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    四、流式細胞儀免疫分型實(shí)驗

    1.樣本采集、運輸、保存和操作
    （1）樣本類(lèi)型：適用于多種臨床標本，如外周血、骨髓穿刺液、骨髓活檢物、淋巴樣組織活檢物、漿液、腦脊液、皮膚、黏膜（內窺鏡活檢物）、細針穿刺物等等。
    （2）抗凝劑的選擇：外周血標本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血標本做白細胞計數和流式分析，則應用EDTA抗凝。骨髓穿刺可用肝素。其他體液用EDTA、ACD或肝素均可，但保存的樣本活性可能會(huì )降低，EDTA的優(yōu)點(diǎn)是成熟髓性細胞貼壁造成的損失及血小板聚集較小，但細胞散射光特征丟失較肝素標本快；由于相對大量的ACD會(huì )通過(guò)改變pH而影響骨髓細胞活性問(wèn)題，通常不推薦用ACD做骨髓穿刺抗凝劑。
    （3）樣本的保存：樣本的完整性和細胞活性與抗凝劑的選擇、運輸、保存和溫度息息相關(guān)。
    ①理想狀態(tài)下，樣本應在采集后立刻進(jìn)行處理和染色。
    ②短期保存（1小時(shí)或更短）應在室溫（18-22℃）。
    ③長(cháng)時(shí)間保存血或骨髓標本室溫即可，有些樣本可能4℃為佳。
    ④標本保存的時(shí)間上限取決于標本類(lèi)型及其保存條件。
    ⑤肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小時(shí)；
    ⑥EDTA抗凝的血和骨髓可保存至12－24小時(shí)。
    ⑦ACD抗凝的血和骨髓可保存至72小時(shí)，但
    ⑧對于只做胞內染色的樣本，可固定細胞以長(cháng)期保存。但？quot;固定－染色“的方法取決于要分析的抗原特性和染色方式，采用之前一定要進(jìn)行新鮮標本的對照和驗證實(shí)驗。

    2.樣本制備
    （1）單細胞懸液的制備
    ①血和骨髓：天然單細胞懸液。當有血凝塊時(shí)，應用50um尼龍網(wǎng)過(guò)濾，同時(shí)進(jìn)行細胞計數和血涂片以判斷靶細胞群體是否仍然存在。
    ②組織塊：機械分離和酶分離兩種方法。分離不僅是要獲得最大產(chǎn)量的單細胞懸液，還要盡量保證細胞結構的完整性和抗原性。大多數淋巴樣組織可用輕柔的機械方法快速分離，并保持收獲細胞的相對完整。某些組織由于細胞間連接緊密，需在機械分離的基礎上用蛋白水解酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶。骨髓標本亦可能因骨細胞成分污染而需要酶消化。但使用酶法一定要確認酶的使用沒(méi)有改變、減弱靶抗原的表達，細胞活性沒(méi)有顯著(zhù)降低。
    （2）分離靶細胞群體
    樣本的任何處理方式都可能導致靶細胞群體的丟失。所以應盡可能使用最接近原始標本狀態(tài)的處理過(guò)程。去除紅細胞是流式分析要求的至少步驟。兩種方法：
    ① 紅細胞裂解：較佳。操作簡(jiǎn)單、快、并最可能保持原始標本的白細胞分布。溶血劑的選擇應基于其選擇性去除成熟紅細胞而最小程度的影響其他細胞的特點(diǎn)。最好在染色后溶血。若在染色前溶血，需確認：抗原性不被溶血過(guò)程改變； 溶血劑被徹底洗去，細胞和抗體結合的動(dòng)力反應未受影響；所用溶血劑不含固定劑，否則會(huì )影響細胞活性及表面標記結果 。
    ② 度梯度離心：白血病細胞回收較好并可能得到富集，同時(shí)去除死細胞。但費時(shí)，白血病細胞的相對頻率較難分析，某些重要細胞群體可能選擇性丟失。根據密度梯度原理，若白血病細胞沒(méi)有與淋巴細胞相似的浮力密度即可能丟失。所以用此方法時(shí)應檢查各層細胞特性以防止靶細胞的丟失。
    （3）估細胞懸液
    ①樣本外觀(guān)：有嚴重溶血和血凝塊的標本可能會(huì )有白細胞的損壞以及細胞亞群的丟失或改變，應棄用。
    ②細胞丟失和分布：確認細胞形態(tài)和原始標本相似。密度梯度離心之后更應檢查細胞分布。可做血涂片判斷。
    ③細胞計數和濃度調整：廠(chǎng)家推薦的抗體濃度通常是假定靶細胞數量在正常范圍內 （500,000-1,000,000／testAb）。白細胞數量上的顯著(zhù)變化會(huì )帶來(lái)染色模式的變化。而白血病標本常常有異常的白細胞數量，骨髓標本也可能被外周血稀釋?zhuān)@些標本的細胞性可能有極大的變異。因此有些標本沒(méi)有足夠的細胞做流式分析，有些則由于細胞量大，正常濃度下的抗體相對不足，不能飽和所有的結合位點(diǎn)，導致假陽(yáng)性結果。所以染色前的細胞計數非常必要。推薦方法： WBC<1000/uL: 用200uL全血并調整相應溶血劑用量； WBC:1000-10000/uL, 用100uL全血并用溶血劑標準量； WBC:10000-20000/uL, 用50uL全血并調整相應溶血劑用量； WBC>20000/uL，用稀釋至（2）（3）范圍內。骨髓標本常常要在PBS 1:10稀釋后計數。應該指出，由于不同的標本中不同系列的細胞比例不同，調整細胞總數不一定合適每一個(gè)系列特異的抗體。實(shí)驗室若選擇不同于廠(chǎng)家推薦的方法（如自己稀釋抗體），抗體一定需要進(jìn)行測試以得到抗體和細胞的最佳比率。
    ④細胞活性：死細胞對許多抗體有非特異性染色，有些抗原同時(shí)存在于胞膜和胞漿，這就使樣本的細胞活性檢測變得重要，尤其7-AAD或EMA（ethidium monoacide）。活細胞將拒染這些染料。此方法的優(yōu)勢是細胞表面標志和活性分析可同時(shí)進(jìn)行，通過(guò)設門(mén)即可得到活細胞的染色特性。尤其適用于高度壞死的樣本。樣本染色后需固定。應在加固定劑之前洗去多余的7AAD，以保證區分的是固定前細胞的死活狀態(tài)。但隨著(zhù)時(shí)間延長(cháng)，7AAD會(huì )在固定的細胞群體重新分配，死活細胞的區分變難。對于染色后常規固定并在固定后12小時(shí)以上分析的標本，最好用EMA。EMA與死細胞DNA穩定的共價(jià)結合保證了長(cháng)時(shí)間固定后仍能很好地區分固定前的死活狀態(tài)。二是手工檢測：使用Trypan blue 或其他細胞活性染料。
    （4）細胞染色
    ①細胞表面染色：大多數可幫助白血病免疫分型的抗原都在細胞膜上。但由于許多抗原也同時(shí)存在細胞內，所以在細胞表面抗原檢測時(shí)應特別注意保持細胞膜的完整以保證檢測的特異性。例如免疫球蛋白重鏈在細胞內和表面的存在有著(zhù)不同的意義，檢測表面標記必須是未固定的活細胞。
    ②細胞內染色：有些胞內特異性抗原的檢測對白血病的免疫分型尤為重要，如TdT, MPO, cCD3, cCD22, 以及胞漿內Ig的表達。胞內染色的關(guān)鍵是使細胞膜通透，把抗體導入胞漿而不影響細胞結構的完整性。要保證固定和透膜的步驟不影響有關(guān)標記的抗原性以及和抗體的結合。
    ③胞膜和胞內的同時(shí)染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內染色，最后是DNA染色。固定劑和通透劑都可能對細胞和參數有不同的多重影響，應根據情況選擇。每一步染色對熒光素的選擇和抗體的選擇都很重要。如，用于表面標記的熒光素應不被隨后的固定和通透步驟所影響，而對于胞內染色，所用的熒光素應足夠小能穿透到胞膜內。

    3. 抗體組合的確定：
    選擇抗體組合的技術(shù)性考慮：基于血液腫瘤的復雜性，提供一個(gè)通用的抗體選擇策略是不現實(shí)的。國際上迄今也沒(méi)有一致性的抗體組合。應該意識到，沒(méi)有一個(gè)神奇的既小又功能齊全的抗體組合可以解決所有的臨床相關(guān)答案。一個(gè)局限性的小組合也可能影響對樣本的正確評估和分類(lèi)。確認細胞異常的能力與所用抗體的數量直接成正比。
    （1）選擇抗體組合的基本原則如下：
    1）所選的抗體組合應足夠寬，可以鑒別樣本中的所有細胞亞群包括正常和異常群體。抗體的數量越多，檢測的靈敏度越高。應該指出，由于腫瘤細胞常常缺少細胞的正常標記或表達異常，所以特異性抗體一定程度上的重復選擇有時(shí)是必要的。
    2）抗體的選擇應可以區分正常和異常細胞，正常細胞可作為實(shí)驗的內參照，異常細胞的表達比例也更準確。如現在用CD45抗體來(lái)區分正常和幼稚細胞，此方法尤其在幼稚細胞含量少時(shí)更顯優(yōu)勢。
    3）熒光強度和表位密度應同時(shí)考慮。對表達少的抗原表位應盡可能選擇強度強的熒光素。
    4）必要時(shí)用活性檢測排除死細胞較強的非特異性染色。國外統計，約70%組織樣本和48%血或骨髓標本有活性檢測結果。
    5）實(shí)驗人員應了解所用抗體的反應細胞譜，以及與特定熒光素結合后的染色模式。相同的CD編號的不同抗體可能有不同的結合模式。
    （2）常用的方案考慮：大而全的抗體組合：全面了解抗原表達，無(wú)需額外染色，省時(shí)但 費用高。先用篩查試劑了解樣本的一般情況，再根據所得信息采用第二線(xiàn)特異性更高的抗體組。經(jīng)濟，但費時(shí)，也需要正確的抗體選擇的策略性決定。但考慮到所用時(shí)間和設備費用，只有約30%國外實(shí)驗室采用此法。基于臨床或形態(tài)學(xué)的資料，選用有目標性的抗體組合以確認可疑的診斷或分類(lèi)。

    4.樣本獲取
    通常，每個(gè)標本應獲取1-2x104個(gè)有核細胞的熒光和散射光信號，微小殘余病變分析則需5x104個(gè)細胞。惡性細胞常有較寬的大小和粒度范圍，獲取時(shí)最好收集無(wú)門(mén)的數據以保留所有未知異常細胞群體的所有特性。免疫熒光信號要求對數放大和至少256道的分辨率。無(wú)論選擇對數或線(xiàn)性放大都要以保證異常細胞都能被檢測到。

    5.數據分析
    只有通過(guò)多參數分析，才能最大程度地區分異質(zhì)的樣本中的正常和異常細胞。多參數分析意味著(zhù)綜合細胞的光散射和多色熒光特征。最少的要求應是4個(gè)參數（2個(gè)光散射和2個(gè)熒光參數）。采用的參數越多，分析步驟越復雜，流式免疫分型的靈敏度越高。
    （1）分析技術(shù)：數據的分析方式隨樣本的特性、抗體組合及臨床情況的不同而變化。但總的原則是要用多參數的數據創(chuàng )造可以區分正常和異常細胞的圖形，如FSC vs. SSC, FL vs. FL, Scatter vs.FL等，散射光與熒光參數的綜合分析常常能提供有效的信息。
    （2）分析步驟：首先分析所有細胞的抗原表達情況，鑒別出正常細胞和異常細胞群體，正常細胞的表現可以作為整個(gè)實(shí)驗染色過(guò)程的內部參照，提供實(shí)驗一致性與否的客觀(guān)證據，異常細胞則通過(guò)進(jìn)一步設門(mén)分析確定表型特點(diǎn)。
    （3）設門(mén)：即選擇特殊的細胞群體分析其各個(gè)參數的表現，是一個(gè)基本的分析技巧。把分析局限在門(mén)內的細胞群體的前提是門(mén)內的細胞代表所有感興趣的細胞，而且沒(méi)有其他細胞的污染。一般來(lái)說(shuō)，不同疾病的設門(mén)策略亦不同，常用的FSC vs. SSC的設門(mén)方式可能不總是適用于L&L分析，如在急性白血病中，CD45和SSC的雙參數顯示是鑒別幼稚細胞的一個(gè)簡(jiǎn)單而有效的方法；在B細胞淋巴瘤中用一個(gè)全B細胞的抗體設門(mén)來(lái)看抗κ鏈和抗λ鏈的表現；T細胞淋巴瘤時(shí)用一個(gè)全T細胞抗體設門(mén)使腫瘤細胞的分型更加明確。另外，通過(guò)細胞特異的抗原表達確定其光散射區域的”backgate“的方法也很實(shí)用，如通過(guò)CD14vs.CD45的雙參數分析區分多個(gè)區域的淋巴、單核和粒細胞群體。
    （4）分析異常細胞群體：確定異常細胞群體后要進(jìn)一步分析其免疫分型。分析抗原表達要注意：
    ①在 L&L中，定性的描述（陽(yáng)性或陰性）通常要比陽(yáng)性百分率的計算更有價(jià)值。只有在設門(mén)內細胞全部是感興趣的細胞而且熒光分布的形狀可以非常清楚地區分陽(yáng)性和陰性亞群的情況下，陽(yáng)性百分率才有意義。當然，在某些抗原異質(zhì)表達的群體中，可進(jìn)行定性或定量的分析（X% 幼稚細胞CDX陽(yáng)性）；百分率也可用于描述異常和正常細胞的比例。
    ②評估抗原表達強度是分析的重要組成部分。對于一個(gè)特異的抗體而言，熒光強度是抗原密度的反應，同時(shí)也與所用的熒光素和獨特的熒光素抗體復合物有關(guān)。有時(shí)確認異常群體是因為沒(méi)有表達應該表達的抗原，但有時(shí)只能從抗原表達的異常強度來(lái)判斷。如用一些髓性抗原CD14，CD33，CDw65的相對表達強度和散射光特征一起來(lái)確認單核細胞系和粒細胞系的發(fā)展成熟過(guò)程。熒光強度的評估在大多數情況下可以采用定性的資料，但由于試劑和機器上的不同，僅僅基于熒光道數的簡(jiǎn)單標準可能并不足夠，最好以其在相同條件下相對正常細胞的強度來(lái)表示。如CD45，CD8或CD38等在不同細胞上的表達密度相差幾個(gè)對數范圍，CD22或CD4等抗原則在所謂陽(yáng)性范圍內在不同細胞類(lèi)型上的區別較小。
    ③區分弱陽(yáng)性和陰性群體：在某些情況下對診斷有較大的價(jià)值，如B細胞惡性腫瘤的CD5弱表達，但弱表達的判斷卻常常很難。現行的標準如”20%陽(yáng)性“等都仍是人為的標準。依照直方圖上與對照組相比向右移動(dòng)來(lái)判斷陽(yáng)性所需的最小位移也是人為的標準。可用K-S統計來(lái)比較直方圖的區別。亦可選用強的熒光染料，或用過(guò)量未標的抗體阻斷非特異染色，從而判斷弱陽(yáng)性染色的特異與否。

    6. 數據解釋
    雖然對流式免疫分型結果的解釋最好與形態(tài)學(xué)結果綜合考慮，但流式的作用仍遠遠多于對形態(tài)學(xué)結果的簡(jiǎn)單證實(shí)。流式可能幫助形態(tài)學(xué)確認某些診斷，也可能提出之前沒(méi)有考慮的診斷，甚至在一些典型表現下流式免疫分型可以在其他方法的輔助下診斷疾病，但應盡量解釋任何流式結果和其他方法結果上的不一致，流式結果應與臨床、形態(tài)學(xué)、細胞遺傳等其他方法綜合考慮。