幻女**毛片,99热精品免费,日韩欧美亚洲精品,国产床上视频,国产成人精品一区二三区,99ri精品,国产区视频

    一、簡(jiǎn)介：

    SSR簡(jiǎn)單序列重復標記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱(chēng)SSR標記），也叫微衛星序列重復，是由一類(lèi)由幾個(gè)核苷酸（1-5個(gè)）為重復單位組成的長(cháng)達幾十個(gè)核苷酸的重復序列，長(cháng)度較短，廣泛分布在染色體上。由于重復單位的次數的不同或重復程度的不完全相同，造成了SSR長(cháng)度的高度變異性，由此而產(chǎn)生SSR標記或SSLP標記。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以用微衛星區域特定順序設計成對引物，通過(guò)PCR技術(shù)，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，即可顯示SSR位點(diǎn)在不同個(gè)體間的多態(tài)性。

    優(yōu)點(diǎn)：
    （1）標記數量豐富，具有較多的等位變異，廣泛分布于各條染色體上；
    （2）是共顯性標記，呈孟德?tīng)栠z傳；
    （3）技術(shù)重復性好，易于操作，結果可靠。

    缺點(diǎn)：
    開(kāi)發(fā)此類(lèi)標記需要預先得知標記兩端的序列信息，而且引物合成費用較高。

    二、操作程序：

    取葉片→磨樣→提取DNA→PCR擴增→電泳檢測→染色→讀帶標記。

    1、DNA提取

    按照Doyle和Dickson（1987）CTAB法（`Cetyl triethyl ammonium bromide）并略加改進(jìn)的程序進(jìn)行，具體步驟如下：
    ① 成熟期取葉片加液氮研磨成粉末狀，轉入1.5ml離心管中，-20℃冰箱保存；
    ② 加入600μl 65℃的2×CTAB混勻并置于65℃水浴中保溫30-60分鐘；
    ③ 取出，冷卻，上下?lián)u勻后，加入600微升24:1的氯仿異戊醇；
    ④ 12000轉/分鐘離心10分鐘，取上清液于另一個(gè)1.5ml的離心管中；
    ⑤ 加異丙醇，12000轉/分鐘離心10分鐘，倒掉上清液；
    ⑥ 干后用100%的灑精清洗，干后加適量TE。

    2、PCR擴增

    模板DNA的濃度大約25ng/μl,擴增反應體系為20μl。具體如下：
    Sterile ddH2O        11μl
    PCR Buffer              3μl
    dNTP-mix                 0.5μl
    Primer1                     1μl
    Primer2                     1μl
    Taq polymerase      0.5ul（2U/μl）
    DNA                            3μl 
    PCR擴增程序為：（2h30min）

    ① 預變性：94℃，5分鐘；
    ② 變  性：94℃，40秒；
    ③ 退  火：55℃  40秒；
    ④ 延  伸：72℃，1分鐘；
    ⑤ 循  環(huán)：從2到4共38個(gè)循環(huán)；
    ⑥ 72℃下最后延伸5分鐘；4℃ 5min，擴增產(chǎn)物置于4℃的冰箱保存。

    3、擴增產(chǎn)物的電泳分離

    制膠→灌膠→上樣→電泳。

    擴增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺變性膠電泳分離，步驟如下：
    ① 準備電極液（1×TBE）；
    ② 將梳子撥出，并迅速用電極液沖洗膠面；
    ③ 不預電泳。
    ④ 點(diǎn)樣，電泳220V；
    ⑤ 拆板，并及時(shí)將內板、邊條及梳子洗凈。

    4、凝膠染色

    ① 固定：10%醋酸，5分鐘；
    ② 染色：10分鐘；
    ③ 漂洗：dH2O，5-10秒；
    ④ 顯色：甲醛-NaOH，直到滿(mǎn)意為止；
    ⑤ 漂洗：dH2O，2分鐘。

    5、自封帶封膠，讀帶標記，數碼照相攝像，室溫風(fēng)干。