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    一、原理

    SNP（Single Nucleotide Polymorphism）即單核苷酸多態(tài)性，是由于單個(gè)核苷酸改變而導致的核酸序列多態(tài)性（Polymorphism）。據估計，在人類(lèi)基因組中，大約每千個(gè)堿基中有一個(gè)SNP，無(wú)論是比較于限制性片段長(cháng)度多態(tài)性（RFLP）分析還是微衛星標記（STR），都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的最小單位，據估計，人類(lèi)的所有群體中大約存在一千萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)。一般認為，相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。于是，我們把位于染色體上某一區域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)稱(chēng)作單體型（haplotype）。大多數染色體區域只有少數幾個(gè)常見(jiàn)的單體型（每個(gè)具有至少5%的頻率），它們代表了一個(gè)群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。一個(gè)染色體區域可以有很多SNP位點(diǎn)，但是我們一旦掌握了這個(gè)區域的單體型，就可以只使用少數幾個(gè)標簽SNPs（tagSNP）來(lái)進(jìn)行基因分型，獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。

    二、樣品準備

    1. DNA抽提
    ①取新鮮肌肉組織約100mg，PBS漂洗趕緊，置于1.5ml離心管中，加入液氮，迅速磨碎。
    ②加200μl 緩沖液GA，震蕩至徹底懸浮。加入20μl 蛋白酶K（20mg/ml）溶液，混勻
    ③加220μl 緩沖液GB，充分混勻，37℃消化過(guò)夜，溶液變清亮。加220μl 無(wú)水乙醇，充分混勻，此時(shí)可能會(huì )出現絮狀沉淀。
    ④將上述一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB 中，（吸附柱放入廢液收集管中）12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
    ⑤加入500μl 去蛋白液GD（使用前請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。
    ⑥加入700μl 漂洗液GW（使用前請先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm離心30 秒，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液GW, 12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。將吸附柱CB 放回廢液收集管中，12000rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液。
    ⑦將吸附柱CB 轉入一個(gè)趕緊的離心管中，加入100μl 洗脫緩沖液（洗脫緩沖液應在60-70℃水浴預熱），混勻，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。洗脫第二次，將洗脫緩沖液50μl 加入吸附柱中，室溫放置15 分鐘，12000rpm 離心30 秒。
    ⑧采用Beckman DU® 640 spectrophotometer 檢測提取到的基因組DNA 濃度，在OD260 處有顯著(zhù)吸收峰。同時(shí)檢測純度，OD260/280 的值應為為1.7-1.9。
    ⑨從原液中取出相應體積DNA 溶液，稀釋致50ng/ul，原液置于-70℃保存，稀釋液置于-20℃保存。

    2. PCR擴增目的片段
    按相關(guān)的試劑說(shuō)明在標準反應管中準備反應體系，典型的PCR反應體系如下（20ul體系）：
    向左扳動(dòng)儀器蓋子上的手柄，揭開(kāi)儀器蓋子，小心放置樣品管于儀器的相應樣品孔中，輕輕蓋上蓋子，將頂部的旋鈕慢慢旋緊，讓熱蓋緊密接觸樣品管，樣品放置完畢。

    3. 在T1型PCR儀上編輯一個(gè)程序
    按[C programs]進(jìn)入編輯模式。要在主目錄中創(chuàng )建一個(gè)程序請按[D enter]。要進(jìn)入一個(gè)子目錄，用→鍵將光標向右移動(dòng)，然后用↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄。按[D enter]進(jìn)入選擇的子目錄。
    輸入程序中要求的溫度：用[D enter]確認溫度。為其輸入時(shí)間，用小數點(diǎn)來(lái)間隔。順序為h.m.s。用[D enter]確認時(shí)間設置，或者用光標鍵移動(dòng)到下一個(gè)區域。＃表示循環(huán)的次數。設定循環(huán)值=總循環(huán)值-1，即，總循環(huán)數為30時(shí)應輸入“29”。用[C pgm ok]來(lái)儲存一個(gè)完整的程序。程序數據永久的儲存在記憶中。

    4. 運行程序
    按[B start/stop]選擇一個(gè)程序。用→↑↓鍵選擇一個(gè)子目錄，或者用[D enter]進(jìn)入主目錄。輸入您想要啟動(dòng)的程序的號碼。或者，按[A list]在該子目錄中的所有程序的列表中選擇一個(gè)程序。用↑↓鍵在列表中滾動(dòng)選擇。用[D enter]確認用強光突出的程序。按[D start]啟動(dòng)程序。

    5. 控制測試過(guò)程
    運行過(guò)程中，按A按鈕，可以獲得程序剩余的時(shí)間信息。運行完成后，按STOP按鈕終止實(shí)驗，按YES確認終止。小心旋開(kāi)熱蓋，按照放置樣品的操作順序，打開(kāi)蓋子，取出實(shí)驗樣品，再蓋上蓋子，關(guān)閉電源，本次實(shí)驗結束。

    6. PCR產(chǎn)物測序
    由專(zhuān)門(mén)負責測序的服務(wù)公司完成

    7. 數據分析
    少量可人工讀取，大量可軟件讀取。比對發(fā)現的SNP在基因組中的位置：重點(diǎn)是啟動(dòng)子區、外顯子區域（包括編碼區的cSNP及5‘及3'UTR）、剪切邊界等，密碼子的改變是否導致氨基酸的改變：錯義突變、無(wú)義突變、終止突變。

    8. 注意事項
    ① 為保證待測目的區域測序真實(shí)可靠，引物設計應該使待測目的區域邊界距離上下游引物至少各50bp；
    ②引物設計建議使用在線(xiàn)方式，以保證成功率；
    ③為保證測序敏感性，PCR產(chǎn)物片段大小應在250bp－650bp范圍；
    ④為方便實(shí)驗，建議引物合成時(shí)分裝成1 o.d/管，方便將PCR與測序的引物分開(kāi)；
    ⑤為保證引物的特異性，建議引物設計后在NCBI上blast確認；
    ⑥為防止降解，PCR產(chǎn)物應盡快測序，否則應該保存在-20℃，且時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)；
    ⑦為保證結果真實(shí)性，建議對關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行反向測序確認。