幻女**毛片,99热精品免费,日韩欧美亚洲精品,国产床上视频,国产成人精品一区二三区,99ri精品,国产区视频

    染色體非整倍體異常是指細胞中個(gè)別染色體的增多或減少形成的染色體數目異常。產(chǎn)前診斷中最常見(jiàn)的胎兒非整倍體異常有21-三體、13-三體、18-三體以及性染色體綜合征等。染色體整倍體改變多導致流產(chǎn)，而非整倍體改變可以出生能存活的出生缺陷兒。因此，檢測胎兒非整倍體異常是許多孕婦接受產(chǎn)前診斷的主要原因。傳統的產(chǎn)前診斷措施是采用侵入性方法獲取胎兒物質(zhì)，如絨毛取樣、羊水穿刺和胎兒臍靜脈穿刺等，這些操作會(huì )給胎兒帶來(lái)一定的風(fēng)險。

    1969年Walknowska等在懷男胎的孕婦血液循環(huán)中發(fā)現了46，XY的中期分裂相，因此提出母血中可能存在著(zhù)胎兒細胞。這一觀(guān)點(diǎn)引起了人們對無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷的興趣。研究者希望從母血中富集胎兒細胞獲得胎兒染色體信息，由于母體循環(huán)中的胎兒細胞數量稀少，細胞的富集過(guò)程既復雜且價(jià)格昂貴，所以至今尚不能應用于臨床。1997年，Lo等在孕婦的血漿和血清中檢出了游離的胎兒DNA。2000年P(guān)oon等在孕有男胎的孕婦血漿中首次發(fā)現Y染色體特異的RNA，這些發(fā)現為無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常開(kāi)創(chuàng )了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。本文就無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的研究及其進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述。

    一、利用孕婦外周血中胎兒細胞診斷胎兒非整倍體異常

    利用孕婦外周血中胎兒細胞產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體異常，其主要優(yōu)勢在于分離提取的胎兒細胞所提供的是純凈的胎兒核酸，含有完整的胎兒基因組DNA，因此能夠進(jìn)行完整的胎兒染色體核型分析。這是孕婦外周血中胎兒游離DNA或游離RNA所無(wú)法比擬的。已發(fā)現的孕婦外周血中胎兒細胞主要有滋養細胞、胎兒有核紅細胞（nucleated red blood cell，NRBC）、淋巴細胞和粒細胞等。近年還發(fā)現一種類(lèi)似于干細胞的胎兒細胞存在于孕婦外周血中。目前為止研究較多的是NRBC。相對其他細胞來(lái)說(shuō)，NRBC是單核細胞，壽命短且穩定，增殖能力有限，不能滯留到下次妊娠。另外，NRBC有明顯形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和特殊的細胞表面標志物，易于識別。因此 NRBC被認為是理想的無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷的靶細胞而受到較多的關(guān)注。

    1991年，Price首次應用18號染色體特異性探針對母血中胎兒細胞進(jìn)行檢測，診斷出1例18-三體胎兒。Bischoff等采集40例孕婦外周血，以抗CD71和CD45單抗標記NRBC，用流式細胞儀分離胎兒細胞，以 X、Y、13、18和21號染色體特異性探針進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH），準確測定出2例21-三體的胎兒。另外也有研究者報道通過(guò)FISH方法檢測出21-三體綜合征、13-三體綜合征和18-三體綜合征等染色體非整倍體病例，并且有較低的假陽(yáng)性率。

    為了評價(jià)利用孕婦外周血中胎兒細胞進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前診斷或篩查胎兒染色體異常是否可以應用于臨床，由美國**衛生研究院支持，美國兒童健康和發(fā)展研究院（nationalinstitute of child health and development，NICHD）發(fā)起了一個(gè)大規模的臨床研究，由Bianchi等共收集了6個(gè)中心2 744例樣本，采用磁性激活細胞分選法（magnetic activated cell sorting，MACS）或熒光激活細胞分離技術(shù)（fluorescence activated cellsorting，FACS）富集胎兒細胞，并用FISH方法檢測獲得的單胎男性胎兒間期細胞，結果發(fā)現MACS和FACS分離富集胎兒細胞的效率分別為44%和13%，與羊水或絨毛核型分析相比對胎兒染色體非整倍體異常檢測的敏感性為60%。表明胎兒細胞可用來(lái)診斷胎兒非整倍體，但尚不能滿(mǎn)足臨床應用的要求。

    影響胎兒細胞應用于臨床診斷的因素首先是富集效率低，能獲得的胎兒細胞數量太少。也有研究發(fā)現孕婦外周血中NRBC不只是來(lái)自胎兒，也含有母源細胞。Troeger等利用Y染色體特異標志物和RhD基因對富集到的有核紅細胞進(jìn)行分析，發(fā)現孕婦外周血中NRBC僅大約50%為胎兒源性。因此，在利用NRBC進(jìn)行非創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷時(shí)，須對分離到的NRBC來(lái)源進(jìn)行鑒定，以保證結果的準確性。

    在對分離到的胎兒NRBC進(jìn)行染色體分析時(shí)，FISH是最常用的方法。巴塞爾實(shí)驗室的研究發(fā)現，對鑒定后的NRBC，采用FISH方法時(shí)，大多數細胞難以進(jìn)行熒光標記。這可能是由于母體循環(huán)中的胎兒細胞具有凋亡特征，細胞核的密度增高以及這些胎兒細胞從相對低氧的胎兒環(huán)境進(jìn)入到富氧的母體循環(huán)，細胞受到影響的原因。而且在FISH結果分析中，研究者必須目測篩選成百上千個(gè)分裂間期核，勞動(dòng)強度高，并帶有主觀(guān)性。這些因素都影響了孕婦外周血中胎兒NRBC在產(chǎn)前診斷中的應用。

    盡管如此，圍繞著(zhù)利用胎兒細胞進(jìn)行無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷的工作仍然在不斷地探索中。策略之一是尋找新的胎兒NRBC特異性標志物。另外，改進(jìn)或選擇新的胎兒NRBC的富集方法和分選技術(shù)也是研究的方向。如使用合適的重量克分子滲透壓濃度結合二倍密度梯度離心法可大幅度提高胎兒NRBC富集效率。Huang等使用微流體磁化方法分離NRBC，可將分離率提高10～20倍，采用散射光譜技術(shù)能夠提高鑒別胎兒NRBC的能力。基于FISH掃描的自動(dòng)化顯微操縱技術(shù)用于檢測早、中期妊娠母血標本也顯示出良好的應用前景。類(lèi)似于干細胞的胎兒細胞被認為可能適宜進(jìn)行細胞培養，如果孕婦外周血中胎兒細胞能夠培養成功，可以獲得足夠的用于核型分析的胎兒細胞，再結合改進(jìn)的FISH技術(shù)，如光譜核型分析（spectral karyotyping，SKY），可能使得非侵入性產(chǎn)前診斷胎兒非整倍體出現突破性進(jìn)展。

    二、利用孕婦血漿中細胞游離胎兒DNA檢測胎兒非整倍體

    自1997年Lo等在孕婦血漿和血清中檢出游離胎兒DNA以后，關(guān)于游離胎兒DNA的臨床應用研究受到許多關(guān)注。有研究發(fā)現懷有染色體非整倍體胎兒的孕婦，其血漿或血清中胎兒游離DNA濃度高于懷有正常胎兒的孕婦，但是在部分正常和非正常妊娠之間胎兒游離DNA濃度存在重疊。另外，在孕11～17周，胎兒DNA平均含量?jì)H占孕婦血漿中細胞游離總DNA含量的大約3%。母源性游離DNA占絕對優(yōu)勢，這就意味著(zhù)使用傳統的DNA提取技術(shù)和熒光定量PCR方法難以對胎兒染色體非整倍體異常進(jìn)行準確診斷。

    解決這一問(wèn)題的途徑之一是可以通過(guò)改進(jìn)提取方法，增加提取的胎兒DNA的濃度或抑制母體DNA濃度，減少背景DNA。有研究表明，母血循環(huán)中胎兒DNA分子一般比母體DNA分子要短，絕大部分小于313 bp。Deng等報道，擴增片段長(cháng)度在180 bp以下的Y特異的短串聯(lián)重復序列，可以提高胎兒等位基因的檢出率。Jorgez等利用凝膠電泳方法選擇性回收母血中不同大小片段DNA，結合全基因組掃描分析，發(fā)現回收100～300 bp范圍的片段，可以獲得更多的細胞游離胎兒DNA。Dhallan等認為在抗凝的外周血中加入少量10%甲醛可減少母體血液中白細胞裂解，從而增加游離胎兒DNA在母體DNA中比例。但是一些研究結果不支持這一觀(guān)點(diǎn)。

    克服上述不足的另一個(gè)途徑是尋找孕婦外周血中新的胎兒特異性標志物，使之能夠像檢測Y特異序列或RhD血型一樣，不受高濃度母體背景DNA的影響。近年來(lái)表觀(guān)遺傳學(xué)的研究為這一設想提供了可能。表觀(guān)遺傳是指DNA序列不發(fā)生變化但基因表達卻發(fā)生了可遺傳的改變。DNA甲基化是最早發(fā)現也是最重要的基因表觀(guān)修飾方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化轉移酶的作用下使CpG二核苷酸 5′端的胞嘧啶轉變?yōu)?5′甲基胞嘧啶。這種 DNA修飾方式并沒(méi)有改變基因序列，但是它調控了基因的表達。一般情況下，DNA甲基化能關(guān)閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。

    2002年P(guān)oon等利用甲基化特異性 PCR方法，不僅從母血漿中檢測到胎兒從父系繼承下來(lái)的甲基化等位基因，還檢測到從母系繼承來(lái)的胎兒非甲基化等位基因，說(shuō)明胎兒與母體之間的基因位點(diǎn)上存在不同的甲基化形式。這一結果為無(wú)創(chuàng )傷性診斷胎兒非整倍體提供了依據。Chim等研究顯示，編碼maspin 基因的SERPINB5基因，在胎盤(pán)細胞中處于低甲基化，而在母血細胞中處于高甲基化。因為胎盤(pán)是血漿中游離胎兒DNA的主要來(lái)源，而母血細胞是血漿中母體DNA的主要來(lái)源，推測利用胎兒和母血細胞之間存在的DNA甲基化狀態(tài)的差異，可以進(jìn)行胎兒非整倍體的檢測。而maspin 基因位于18號染色體，因此可以通過(guò)檢測maspin 基因的甲基化情況，診斷胎兒18-三體。

    在此研究思路下，Tong等應用表觀(guān)遺傳學(xué)等位基因比率（epigenetic allelic ration，EAR）分析方法，利用maspin 基因啟動(dòng)子區域內的一個(gè)雜合性SNP位點(diǎn)（A/C），進(jìn)行等位基因定量分析。發(fā)現妊娠有該雜合SNP 位點(diǎn)正常二倍體胎兒的孕婦，外周血中兩種低甲基化的maspin等位基因的比率為1∶1，而妊娠18-三體綜合征胎兒的孕婦，外周血中兩種低甲基化的maspin等位基因的比率為1∶2或2∶1，從而證明聯(lián)合利用此差異性甲基化位點(diǎn)和位于此位點(diǎn)的SNP位點(diǎn)，可以進(jìn)行胎兒18-三體的無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前診斷。但是，這種方法也有明顯的不足，一個(gè)限制就是母親必須是C/C純合子，胎盤(pán)的基因型必須是A/C雜合子，但這種變異很少見(jiàn)，或許還存在種族差異，比如在129例高加索人的胎盤(pán)中未發(fā)現C等位基因。另外也有一個(gè)技術(shù)問(wèn)題就是甲基化特異性 PCR過(guò)程中使用的重亞硫酸鹽轉換步驟，能夠導致本來(lái)就很少的胎兒DNA模板被大量破壞，這將嚴重妨礙試驗的效果。因此，有必要探索更恰當的試驗方法或策略。

    唐氏綜合征由于其發(fā)病率高而備受關(guān)注，為了尋找21號染色體的表觀(guān)遺傳標記，Hultén等采取了3種策略進(jìn)行篩選，結果在21q22.3發(fā)現了3個(gè)差異甲基化序列。其中AIRE基因啟動(dòng)子區域的CpG位點(diǎn)高度差異甲基化，可作為無(wú)創(chuàng )性產(chǎn)前診斷唐氏綜合征重要的候選表觀(guān)遺傳標記。Chim等采用甲基化敏感的單核甘酸引物延伸和（或）重亞硫酸鹽測序的方法，系統性搜尋21號染色體上的甲基化位點(diǎn)，在114個(gè)CpG島中，有22個(gè)顯示出母體和胎兒間的表觀(guān)遺傳學(xué)差異。隨著(zhù)這些表觀(guān)遺傳標記研究的不斷深入，有可能使無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體成為現實(shí)。

    三、利用孕婦血漿中細胞游離胎兒mRNA檢測胎兒非整倍體

    2000年 Poon等在孕有男胎的孕婦血漿中首次檢測到 Y染色體特異性鋅脂蛋白（**Y）mRNA。此后許多研究證實(shí)了孕婦外周血中存在著(zhù)游離胎兒RNA。這些游離胎兒RNA主要來(lái)自胎盤(pán)，在孕婦血漿中含量豐富，具有極好的穩定性，并且與血漿中胎兒DNA一樣，于產(chǎn)后迅速從血漿中清除。這些特性顯示了利用孕婦外周血中游離RNA檢測胎兒異常是可行的。Lo等報道了測定胎盤(pán)特異性因子4（placental-specific 4，PLAC4）基因表達產(chǎn)物診斷胎兒非整倍體的研究結果。PLAC4基因來(lái)自胎盤(pán)，僅在胎盤(pán)表達，具有胎兒特異性。該基因定位于21號染色體，因此，Lo等推測定量分析孕婦血漿中PLAC4 mRNA可以用于診斷胎兒21-三體綜合征。

    由于普通的熒光定量難以滿(mǎn)足檢測要求，Lo等利用堿基延伸反應和基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測PLAC4 mRNA。他們選擇了PLAC4基因內的SNP雜合位點(diǎn)進(jìn)行等位基因比率定量分析。在正常二倍體，PLAC4 mRNA轉錄的每一個(gè)等位基因量是相等的，其比率應為1∶1；而在非整倍體，如21-三體，其比率將是2∶1或1∶2。Lo等檢測了10例21-三體的胎兒，結果顯示診斷的敏感性為90%，特異性為96%。在57例對照中正確判斷了55例正常二倍體，該研究雖然例數不多，但是很有意義，表明了一種無(wú)創(chuàng )傷性診斷胎兒非整倍體的新的策略方法。該方法的不足之處在于受檢胎兒的SNP位點(diǎn)必須是雜合子，這種基因型只出現于大約50%的被檢者，因此必須發(fā)現更多的SNP位點(diǎn)，或者增加21號染色體特異的細胞游離胎兒RNA的種類(lèi)。胎兒基因表達譜的研究將有助于這項工作的進(jìn)一步開(kāi)展。Tsui等用同樣的RNA-SNP等位基因比率分析方法檢測母血漿中胎盤(pán)特異的SERPINB2基因轉錄的 mRNA，檢測出18三體異常。

    由于MALDI-TOF MS檢測方法的局限性，Lo等將數字PCR用于RNA-SNP的檢測，該方法可以準確計數出微量的模板拷貝數變化，這項技術(shù)優(yōu)于質(zhì)譜之處在于胎兒不必是SNP位點(diǎn)的雜合子，對純合子胎兒也可以檢測，不僅簡(jiǎn)化了操作，而且擴大了應用范圍，提高了檢測的有效性和準確性。Go等[39]將淬滅延伸反應和部分變性高效液相色譜應用于RNA SNP方法 成功檢測出21-三體胎兒，使得RNA SNP方法不必依賴(lài)于昂貴的MALDI-TOF MS設備。

    選擇細胞游離胎兒RNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷的主要優(yōu)勢在于基因轉錄的mRNA的多拷貝性。另一個(gè)優(yōu)勢是胎盤(pán)表達的特異的mRNA種類(lèi)是母體任何組織都不表達的，易于檢測，與前述的利用表觀(guān)遺傳學(xué)差異選擇胎兒特異的標記物一樣，分析胎盤(pán)來(lái)源的RNA類(lèi)似利用胎兒DNA檢測Y特異序列或RhD血型，母體血漿中完全缺乏這種物質(zhì)，因此檢測不受強大的母體DNA背景的干擾。

    四、結語(yǔ)

    每年有成百萬(wàn)孕婦需要接受胎兒染色體異常的產(chǎn)前篩查，高風(fēng)險的孕婦要面對侵入性診斷所帶來(lái)的壓力，而無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷為她們提供了一種理想的、對胎兒無(wú)風(fēng)險的診斷途徑。雖然利用孕婦血漿中胎兒DNA檢測Y染色體特異序列以及RhD血型已經(jīng)常規應用于臨床。但是對胎兒非整倍體異常的無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷仍然存在著(zhù)檢測效率低、實(shí)驗過(guò)程復雜、研究的樣本量小等不足，因此目前尚不能滿(mǎn)足臨床應用的要求。然而，隨著(zhù)孕婦外周血中胎兒物質(zhì)富集技術(shù)的提高、新的檢測方法的應用、多中心研究的開(kāi)展以及診斷策略的完善，這項技術(shù)將最終能夠成為具有臨床價(jià)值的檢測方法。（無(wú)創(chuàng )傷性產(chǎn)前診斷胎兒染色體非整倍體的研究進(jìn)展 劉福民）