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    目前，吉非替尼和厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI）已被證明是治療晚期非小細胞肺癌（NSCLC）的有效靶向藥物，并只對表皮生長(cháng)因子受體（EGFR）基因敏感突變類(lèi)型的肺癌患者才顯示很好療效，肺癌患者在應用EGFR-TKI靶向治療前進(jìn)行EGFR基因突變檢測具有重要臨床意義，而檢測結果的準確性也將直接影響患者靶向治療選擇和療效。本文就肺癌EGFR基因突變的分子病理學(xué)檢測中主要的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證要點(diǎn)進(jìn)行介紹。
 

    1、檢測實(shí)驗室及人員要求

    常規EGFR突變檢測方法基于基因擴增技術(shù)之上，其檢測應嚴格在基因擴增實(shí)驗室進(jìn)行，實(shí)驗室包括試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增區和產(chǎn)物分析區等4個(gè)區。因肺癌EGFR檢測的標本多為石蠟包埋的組織蠟塊，實(shí)驗室應設置***的標本制備預處理區（切片區），嚴防標本在制片過(guò)程中被污染。各工作分區應標識清晰，儀器設備應滿(mǎn)足檢測要求，各工作區專(zhuān)用的儀器設備、辦公用品、工作服、實(shí)驗耗材和清潔用具等不可混用。檢測過(guò)程中嚴格質(zhì)量控制，實(shí)驗完畢后做好清潔消毒工作。

    分子病理學(xué)聚合酶鏈式反應（PCR）實(shí)驗室工作人員應參加我國衛生和計劃生育委員會(huì )指定的機構舉辦的技術(shù)培訓后取得合格證，并定期進(jìn)行培訓。

    2、EGFR突變檢測的標本要求

    需要進(jìn)行EGFR-TKI靶向治療的患者應進(jìn)行EGFR基因突變篩選；臨床標準（女性，無(wú)吸煙史等）不能決定是否進(jìn)行檢測；有研究表明，免疫組織化學(xué)染色（IHC）檢出總EGFR蛋白表達也不推薦TKI治療篩選。

    EGFR突變檢測，對肺癌部分切除標本建議用于腺癌和含腺癌成分的混合型肺癌，不考慮組織學(xué)分級；對肺癌全切標本，不建議用于無(wú)任何腺癌成分的肺癌，例如純鱗癌、純小細胞癌或IHC未顯示腺癌分化的大細胞癌；對小標本（活檢、細胞學(xué)標本），如果不能完全除外腺癌，可檢測組織學(xué)表現為鱗癌或小細胞癌的標本檢測，但應結合臨床標準（年輕患者、無(wú)吸煙史）協(xié)助篩選；對初治患者，檢測原發(fā)灶或轉移灶；對于多發(fā)性原發(fā)肺腺癌，可分別檢測，但不必對同一腫瘤多個(gè)區域檢測。

    在確定EGFR-TKI治療的進(jìn)展期（Ⅳ期）肺癌患者，或低期別患者發(fā)生復發(fā)或進(jìn)展（原先未進(jìn)行檢測）時(shí)，應行EGFR突變檢測。由于肺癌復發(fā)轉移率高，對Ⅰ~Ⅲ期肺癌，在診斷時(shí)鼓勵患者進(jìn)行檢測，以便出現復發(fā)時(shí)及時(shí)治療，但應視具體情況決定。

    3、EGFR突變檢測流程

    標本處理手術(shù)或活檢組織標本應在離體30分鐘內用10%中性福爾馬林固定，避免用酸性、重金屬固定液或脫鈣液等處理；活檢小標本固定6~24小時(shí)，手術(shù)切除大標本固定8~48小時(shí)；細胞學(xué)標本可用于EGFR突變檢測，細胞石蠟包埋塊優(yōu)于細胞涂片。

    標本評估及DNA提取對檢測標本進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)評估是EGFR檢測最重要的質(zhì)量控制之一，病理醫生首先應評估整個(gè)樣本中腫瘤細胞含量（腫瘤細胞百分比），確定標本是否滿(mǎn)足檢測要求（所采用檢測方法的敏感性），必要時(shí)進(jìn)行微切割富集腫瘤，EGFR突變檢測標本使用的切片機刀架座須清潔并消毒，不同標本切片時(shí)要更換刀片；制備3~10張厚8μm組織切片，對照HE染色結果刮取腫瘤細胞豐富區域，避開(kāi)非腫瘤區和壞死區等；采用標準試劑盒提取基因組DNA，并測定DNA濃度。

    EGFR突變檢測EGFR突變檢測方法有很多種，應結合檢測標本特點(diǎn)來(lái)判斷是否進(jìn)行檢測。最傳統的直接測序法（Sanger測序）可得到序列的直接信息，對未知突變的檢出具有優(yōu)勢，是直接有效地檢測基因突變狀態(tài)的方法，但敏感性較低，實(shí)驗操作時(shí)間長(cháng)、步驟復雜、易污染。

    以實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）為平臺的突變檢測技術(shù)，均須根據已知的突變類(lèi)型設計引物和探針，因此無(wú)法檢測出所有可能的突變，但敏感性較直接測序法高，操作簡(jiǎn)單，不必對PCR產(chǎn)物進(jìn)行操作，很大程度避免了擴增產(chǎn)物的污染。

    實(shí)驗室應采用能在至少含50%腫瘤細胞的標本中檢測到突變的方法。推薦采用更敏感的方法，至少能在含10%腫瘤細胞的標本中檢測到突變，但不可一味追求高敏感性，而忽視對特異性和準確性的考量。

    另外，不同實(shí)驗條件、不同樣本中檢測的最適方法也可能不同，應根據實(shí)際情況選擇適合的EGFR基因突變檢測方法，通過(guò)預實(shí)驗驗證所采用方法的準確性和敏感性，無(wú)論采用何種檢測方法，臨床EGFR基因突變檢測應能檢測所有突變頻率在1%以上的突變類(lèi)型。

    EGFR突變檢測結果分析與報告EGFR突變檢測根據各自檢測方法的判讀標準分析檢測結果。測序法檢測EGFR基因突變，成功的峰形圖的峰形規則，如圖1，RT-PCR法檢測EGFR基因突變結果如圖2所示；如果檢測結果可疑（圖3，4），應重復進(jìn)行檢測或采用其他的檢測方法驗證。

    EGFR突變檢測報告須包括結果和說(shuō)明，報告內容應讓腫瘤醫生和其他病理醫生易于理解，檢測實(shí)驗室收到標本后2周（10個(gè)工作日）內簽發(fā)報告，平均檢測周期＞2周的實(shí)驗室應有措施（自身或第3方實(shí)驗室）來(lái)保證緊急病例能更快得到檢測結果。

    4、EGFR突變檢測的其他質(zhì)量控制與質(zhì)量保證

    分子檢測實(shí)驗室人員應嚴格按照已經(jīng)驗證的標準化操作流程進(jìn)行EGFR檢測，EGFR突變檢測驗證應與其他分子診斷相同，每次實(shí)驗設置陰性和陽(yáng)性質(zhì)控，定期總結檢測結果，及時(shí)發(fā)現并解決問(wèn)題。

    實(shí)驗室每月采用不同的檢測平臺驗證一定數量的EGFR基因突變檢測結果，每年應至少參加兩次單項能力驗證（室間質(zhì)控）。

    驗證機構有我國衛生計生委病理質(zhì)控中心（PQCC），國際機構如美國病理學(xué)家學(xué)會(huì )（CAP），歐洲分子基因診斷質(zhì)量聯(lián)盟（EMQN）等。

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