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    美國密蘇里州堪薩斯城斯道爾醫學(xué)研究所Fengchao Wang博士等人建立了優(yōu)良的功能學(xué)實(shí)驗以區分小鼠及人類(lèi)的腸道干細胞，并鑒定出了人和小鼠腸道干細胞可靠的表面標志物。鑒定腸道干細胞在很大程度上依賴(lài)轉基因報告小鼠模型。但是該研究方法受到嵌合型表達的限制而且很難在人體組織中直接應用。作者主要采用免疫組化、實(shí)時(shí)定量逆轉錄聚合酶鏈反應以及熒光激活流式細胞分選技術(shù)分別分析小鼠和人類(lèi)腸道組織原代獲取的上皮細胞。我們在分選表達Lgr5標記的綠色熒光蛋白細胞的基礎上，分析不同表面標志物的組合。我們開(kāi)發(fā)了一種培養流程能夠便利地從小鼠腸道分離出功能性腸道干細胞。

    并利用人腸道隱窩細胞和公認的人腸道干細胞對該實(shí)驗方法進(jìn)行了驗證。流式細胞儀篩選結果顯示小鼠表面標志物為CD44(+)CD24(lo)CD166(+) 的小腸和結腸腸粘膜上皮細胞高表達干細胞相關(guān)基因。根據表達GRP78或c-Kit的情況排除過(guò)渡型增殖細胞及祖細胞。小鼠小腸粘膜分離出的CD44(+)CD24(lo)CD166(+) GRP78(lo/-)細胞推定為腸道干細胞，包含有Lgr5-GFP(hi)和Lgr5-GFP(med/lo) 兩個(gè)亞群。利用GSK抑制劑CHIR99021及E-鈣粘著(zhù)蛋白穩定劑Thiazovivin進(jìn)行培養，單獨分離出的腸道干細胞中25%-30%可以形成集落。研究結果表明， CD44(+)CD24(lo)CD166(+)GRP78(lo/-)以及CD44(+)CD24(lo)CD166(+)c-Kit(-)可以簡(jiǎn)單易行地分離純化出小鼠小腸及結腸干細胞。

    CD44(+)CD24(-/lo)CD166(+)同樣可以鑒定出人腸道干細胞。這些發(fā)現為進(jìn)一步研究小鼠及人腸道干細胞的功能提供了基礎。研究背景：因腸道上皮細胞具有結果簡(jiǎn)單、更新速度快的特點(diǎn)，所以為研究成年哺乳動(dòng)物干細胞的功能提供了良好的模型。小鼠體內遺傳標記結合世系追蹤是一種很好的鑒定小鼠腸道干細胞的方法。然而此種方法依賴(lài)轉基因或基因敲入技術(shù)將標記蛋白例如Lgr5-綠色熒光蛋白轉入小鼠體內構建轉基因小鼠模型以鑒定隱窩柱狀細胞，并通過(guò)結構報告Bmi-1、mTert、Hopx和Lrig 1以標記+4位置的腸道干細胞。而且，這些轉基因報告小鼠模型經(jīng)常馬賽克融合表達基因。更重要的是由小鼠中鑒定出的亞群無(wú)法直接應用于人類(lèi)相關(guān)研究。這就大大限制了在人體對腸道干細胞功能的研究。多項研究利用鑒定單一基因的表達來(lái)區分腸道干細胞，如EphB2、CD24和CD166等。

    但單一表面標志物并不能有效地將祖細胞和分化細胞分開(kāi)。例如EphB2在超過(guò)60%的人隱窩細胞中存在不同程度的表達。即使是EphB高表達的細胞群中也同時(shí)包括了腸道干細胞和Muc2+的祖細胞。表達Sox9-GFP或CD24+的分離的腸道干細胞其集落形成率僅0.2%-0.6%。由此可見(jiàn)，上述所有單一的細胞表面標志物均不能很理想地分離腸道干細胞。所以鑒定能高效分離腸道干細胞的細胞表面標志物集合具有重要意義。然而在體外培養腸道干細胞存在一定的困難，其良好的生長(cháng)依賴(lài)潘氏細胞的存在。雖然有報道稱(chēng)Wnt3a可在體外培養細胞中取代潘氏細胞，但也存在爭議。有學(xué)者指出Lgr5+的隱窩柱狀細胞只有在與潘氏細胞混合而不是Wnt3a存在的情況下才可生長(cháng)良好。在結腸不存在潘氏細胞的情況下c-Kit+的杯狀細胞可以支持結腸干細胞的生長(cháng)但效率很低。由此可見(jiàn)開(kāi)發(fā)出一套優(yōu)良的體外培養系統對于腸道干細胞研究十分重要。

    在本研究中，我們在Lgr5不同表達水平的基礎上，鑒定了小鼠腸道干細胞的表面標志物組合，并采用新的培養方法研究了這類(lèi)細胞的功能特性。這個(gè)方法在流式細胞儀分離鑒定的人腸道干細胞以及隱窩細胞中得到了驗證。近期發(fā)現腸道干細胞存在2個(gè)亞群在調節腸道組織內穩態(tài)方面發(fā)揮作用。一是定位于潘氏細胞區域接近+4位置的與潘氏細胞、靜止期腸道干細胞混合在一起的隱窩柱狀上皮細胞有著(zhù)快速循環(huán)更新的特性。報道指出隱窩柱狀上皮細胞表達所有+4區域腸道干細胞表面標志物。另一類(lèi)是近期研究發(fā)現當發(fā)生基因消融或射線(xiàn)損傷時(shí)，定位在潘氏細胞區域以上的腸道干細胞儲備亞群被激活并取代損傷上皮細胞。然而遺憾的是并未鑒定出能夠區分該亞型腸道干細胞的表面標志物。