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    作者：南京鼓樓醫院    施曉雷  韓冰  丁義濤

    導讀：我國是乙肝大國，乙型肝炎病毒攜帶者約占世界總數的三分之一，其中相當一部分患者會(huì )逐步發(fā)展成急性或慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，最終發(fā)展為肝功能衰竭。然而，由于供體器官?lài)乐囟倘钡榷喾N原因，目前僅少部分肝功能衰竭患者獲得肝移植機會(huì )。因此，能夠取代部分肝臟功能的人工肝支持系統得以迅速發(fā)展。

    人工肝支持系統包括非生物人工肝（ALS）和生物人工肝（BAL）。前者不含生物組分，主要利用濾過(guò)和吸附原理清除毒素，類(lèi)似于血液透析治療。但ALS不能完全替代肝臟，這就促使肝病工作者致力于含有生物成分，能夠綜合發(fā)揮肝臟氧化脫毒、生物轉化、分泌與合成等功能的BAL研究。

    BAL核心元件一：生物反應器

    生物反應器是BAL核心組成部分，理想BAL反應器應能達到：①為肝細胞提供良好的長(cháng)期生長(cháng)代謝環(huán)境；②能發(fā)揮必需的肝臟功能；③體積小，死腔少。就結構而言，目前生物反應器分以下4種。

    中空纖維管式  中空纖維管分為內腔和外腔，一般將肝細胞黏附生長(cháng)于外腔，內腔有血漿通過(guò)，是目前應用最多的一類(lèi)反應器。中空纖維管反應器最大優(yōu)點(diǎn)是較大的表面積/體積比，便于代謝物轉運，且保持最小死腔。但由于肝細胞在反應器中分布不均，易造成細胞活力下降。

    單層/多層平板式  該反應器是將肝細胞直接種植于平板上，優(yōu)點(diǎn)是細胞分布均勻，微環(huán)境一致，但表面積與體積之比下降。本中心在國內第一個(gè)自主研發(fā)新型多層平板型生物反應器。反應器大致由三部分組成：多層平板、中空支架和外殼。本反應器特點(diǎn)為：①體積僅480ml,對人體血液動(dòng)力學(xué)無(wú)影響；②能承載1010量級細胞，滿(mǎn)足臨床治療要求。此外，每層平板采用電紡方式引入殼聚糖納米纖維支架，促進(jìn)肝細胞與材料間的黏附力，保證細胞數量及其功能維持。

    灌流床/支架式  該生物反應器提供固相載體使肝細胞黏附固定，肝細胞黏附并生長(cháng)于孔隙中，大大降低因介質(zhì)流動(dòng)而造成的剪切力損傷，細胞可維持較高功能活力，輻流式反應器即采用此種構型，其缺點(diǎn)是灌注不均一，易堵塞。

    微囊懸液式  該生物反應器是將肝細胞用一種半透膜材料包裹，制成多孔微囊，然后進(jìn)行灌注培養。其優(yōu)點(diǎn)是所有細胞具有相同微環(huán)境，有大量細胞培養空間，減少了免疫反應發(fā)生。缺點(diǎn)是細胞穩定性差，物質(zhì)交換能力受限。

    BAL核心元件二：細胞材料

    細胞材料是BAL的核心部分，細胞在生物反應器內的活性及自身功能在很大程度上決定了BAL的治療作用。

    人體肝細胞是上皮細胞源性，需要實(shí)質(zhì)細胞之間以及與非實(shí)質(zhì)細胞的接觸發(fā)揮作用，現有BAL裝置無(wú)法完全模擬肝細胞在體內的微環(huán)境。在BAL使用時(shí)的肝細胞大多功能低下，關(guān)鍵酶活性喪失，嚴重影響B(tài)AL效能的發(fā)揮。

    理想的細胞來(lái)源應該是功能上接近在體肝細胞，來(lái)源廣泛且臨床應用時(shí)無(wú)免疫排斥反應及疾病傳播的可能。因此，尋找一種能在BAL中具有高活性、高穩定性的細胞系，是目前亟待解決的問(wèn)題。

    人類(lèi)原代肝細胞  自體肝細胞理論上講不會(huì )發(fā)生免疫排斥反應，是理想的BAL細胞來(lái)源。但臨床上終末期肝病患者自身病態(tài)肝細胞數量和質(zhì)量均不能滿(mǎn)足BAL肝細胞的要求，不可能作為BAL的細胞來(lái)源。

    同種異體肝細胞是另一類(lèi)較好的細胞來(lái)源，但因來(lái)源有限、同種異體存有免疫排斥及從人類(lèi)組織中提取可能會(huì )傳播一些疾病，目前已基本被摒棄。

    永生化肝細胞  這類(lèi)細胞采用成人肝細胞作為源細胞，免疫排斥反應小，但肝功能保留不全，還存在致癌及病毒感染風(fēng)險。

    肝細胞株  在體外具有無(wú)限生長(cháng)潛能的肝細胞株被證實(shí)是BAL一個(gè)有希望的細胞來(lái)源。這些細胞大多是從人類(lèi)肝臟腫瘤細胞分化而來(lái)，而且在體外培養時(shí)顯示出了很好的耐受性。

    HepG2、C3A細胞株是腫瘤源性的肝細胞株，具有無(wú)限增殖能力，在體外培養顯示出良好的活性及穩定性，且具有正常肝細胞的絕大多數功能，如白蛋白合成、P450活性及尿素代謝能力。但C3A細胞本身的代謝解毒能力較弱，且作為腫瘤源性細胞株，理論上仍存在腫瘤定植可能。

    異種肝細胞  異種肝細胞是指由各種動(dòng)物肝臟分離而來(lái)的，其優(yōu)勢在于細胞來(lái)源穩定、分離獲取方便且價(jià)格低廉。豬肝細胞是目前BAL基礎研究與臨床試驗中應用最為廣泛的一種動(dòng)物源肝細胞。

    本中心從方便、實(shí)用、高效等原則出發(fā)，選擇異種豬細胞作為新型BAL支持系統的細胞來(lái)源。

    干細胞  干細胞是另一類(lèi)很有希望的BAL細胞來(lái)源，在去分化狀態(tài)下無(wú)限增值，而且具有良好的分化能力，多種起源的干細胞在組織動(dòng)員方面顯示有一定的前景，特別是在BAL.

    但是，目前應用于BAL的干細胞還處于未成熟階段。其存在問(wèn)題是還沒(méi)有一種完全有效的純化和鑒別干細胞的方法，且目前尚無(wú)法使干細胞在體外擴增至1010數量級，這是其應用最大的“瓶頸”.

    BAL臨床應用前景和面臨難題

    BAL的臨床應用前景是令人鼓舞的，但其廣泛應用仍須努力攻克許多難題，如最佳細胞來(lái)源、體外細胞長(cháng)期穩定性和活性的提高、生物反應器重建肝臟三維結構等。

    現有生物反應器設計只能體現肝細胞實(shí)質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用，而忽視了非實(shí)質(zhì)細胞的重要性。共培養策略可能是一個(gè)比較有前途的開(kāi)拓領(lǐng)域，特別是肝細胞和非實(shí)質(zhì)細胞的共培養可以提高細胞與細胞之間的相互作用。

    肝臟中的肝細胞面臨著(zhù)氧氣和營(yíng)養物質(zhì)的濃度梯度，而這個(gè)梯度是隨著(zhù)其與門(mén)靜脈距離改變而變化，正是由于存在這一梯度，肝細胞顯示了不同功能。為肝細胞可以繼續發(fā)揮在正常肝臟中的所有功能，未來(lái)的生物反應器可能需要重建這種微環(huán)境。

    隨著(zhù)生物工程技術(shù)的不斷創(chuàng )新，未來(lái)的生物反應器應該最大化轉化營(yíng)養物質(zhì)和氧氣，這就需要發(fā)展一種稱(chēng)為三維立體***，重建肝臟三維立體構象，并能精確定位細胞位置。

    最終，理想的生物人工肝應該是由可完全吸收的生物人工肝置入性裝置來(lái)實(shí)現永久的肝臟替代作用。