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    近年來(lái)，隨著(zhù)醫療技術(shù)的發(fā)展，氣管插管、支架、靜脈留置管、人工瓣膜等植入性材料的運用及介入性檢查的日益頻繁，這些技術(shù)在給醫患雙方帶來(lái)便利的同時(shí)也產(chǎn)生了許多新的問(wèn)題，其中最引人注意的就是生物被膜相關(guān)感染日漸增多。在關(guān)注細菌生物被膜的同時(shí)，研究也發(fā)現，近10年來(lái)白色念珠菌感染與生物醫學(xué)材料的大范圍使用呈平行上升趨勢。尤為驚人的是，真菌（主要是白色念珠菌）感染在導管相關(guān)感染中居第三位，在條件致病菌感染中居第二位，并且有很高的病死率。由于生物被膜群體耐藥性極強，可以逃避宿主免疫作用，且感染部位難以徹底清除，是臨床上難治性感染的重要原因之一。本文就白色念珠菌生物被膜的研究進(jìn)展作一綜述。

    1.白色念珠菌生物被膜的形成過(guò)程及結構形態(tài)

    1.1 白色念珠菌生物被膜的形成過(guò)程

    目前，習慣上把白色念珠菌生物被膜的形成過(guò)程分為早期（0～11h）、中期（12～30h）和成熟期（31～72h）。在用96孔微量培養板制成的體外念珠菌生物被膜模型中，用倒置顯微鏡可以觀(guān)察到培養2h在培養孔的底面形成由酵母細胞組成的微菌落；2～4h可見(jiàn)酵母細胞出芽并開(kāi)始形成菌絲；8h微菌落互相融合，形成酵母細胞及菌絲密集排列的網(wǎng)狀結構；24～48h酵母細胞沿著(zhù)菌絲團塊樣聚集，形成多層的膜狀結構。

    1.2 白色念珠菌生物被膜的結構形態(tài)

    成熟的白念珠菌生物被膜是一個(gè)在細胞外基質(zhì)包裹下的由孢子、菌絲體或假菌絲組成的致密網(wǎng)狀系統，呈一個(gè)具有不均質(zhì)性和水道分支的有機三維立體小菌落結構。利用激光共聚焦顯微鏡與熒光染色方法可觀(guān)察到在附著(zhù)于生物材料的基底層是l～2個(gè)細胞厚度的具有代謝活性的芽孢層，位于其上的是厚度為450～550μm相互交織的大量具有代謝活性的菌絲體以及生物膜外表面的多糖基質(zhì)層，各層間有大小不等的間隙及孔道相貫通。正是這種三維空間網(wǎng)狀結構為細胞營(yíng)造了一個(gè)便于物質(zhì)交換及細胞間信號交流的生存環(huán)境。

    2.白色念珠菌生物被膜形成的相關(guān)因素

    2.1 接觸物質(zhì)表面的性質(zhì)

    一方面，接觸物表面的物理性質(zhì)如粗糙與否會(huì )影響真菌附著(zhù)難易及生物被膜的均一性，另一方面，接觸物的化學(xué)性質(zhì)也會(huì )影響生物被膜的形成。有實(shí)驗證明，比起橡膠材質(zhì)，硅酮材質(zhì)要大大減低白色念珠菌生物被膜形成數量。而且，在不同材質(zhì)上，白色念珠菌生物被膜結構也會(huì )有不同，這可能與接觸誘導基因表達有關(guān)。

    2.2 白色念珠菌的形態(tài)種型

    毋庸置疑，白色念珠菌的酵母態(tài)和菌絲態(tài)間相互轉換能力對其生物性及致病性的多重表現是非常重要的。利用已基因分型的無(wú)菌絲和無(wú)酵母的兩種白色念珠菌突變株實(shí)驗可以發(fā)現，前者只能形成生物被膜的基層而后者只能形成易從導壁盤(pán)分離的生物被膜外層，而野生型白色念珠菌則可形成我們上面所說(shuō)明確的兩層生物被膜。由此可知，白色念珠菌的二態(tài)性對其生物被膜的構建及其潛在致病性起著(zhù)決定作用。

    2.3 白色念珠菌生物被膜的密度感應（quorumsensing，QS）系統

    QS系統是生物被膜形成的基礎，QS系統所控制的細胞間的信息交流已被證實(shí)在各種菌群的生長(cháng)過(guò)程中扮演重要角色，通過(guò)QS反饋抑制菌群的復制，使定植群落達到最適大小，形成成熟的生物被膜。實(shí)驗證明，麝香草醇是目前研究最多的QS信號分子，可抑制白色念珠菌的菌絲化，高濃度的麝香草醇幾乎完全抑制生物被膜的形成，而且從成熟生物被膜提取的上清液可以抑制游離白色念珠菌的菌絲化，也有研究表明一些與菌絲形成相關(guān)的基因及耐藥基因和編碼一些蛋白的基因的表達與麝香草醇條件相關(guān)聯(lián)。另外一種研究較多的QS信號分子是酪醇，為酪氨酸衍生物，在白色念珠菌細胞生長(cháng)和生物被膜結構形成中起了重要作用。有實(shí)驗提示，麝香草醇在生物被膜形成的早中期促進(jìn)了菌絲的生長(cháng)，而酪醇則是在之后階段刺激生物被膜釋放酵母細胞使生物體散布至新的表面定居。目前還有如苯基乙醇、色醇等QS信號分子被報道，但其生理機制還不明確。總之，QS系統和生物被膜的形成是一種復雜調控，值得我們進(jìn)一步研究和探討。

    2.4 其他

    對于白色念珠菌生物被膜的形成還存在許多其他的影響因素，如溫度﹑營(yíng)養等環(huán)境因素，在此就不一一贅述。

    3.白色念珠菌生物被膜耐藥機制

    研究表明，沒(méi)有哪種明確單一因素能引起生物被膜如此高的耐藥性，而研究已知的幾種因素確實(shí)對白色念珠菌生物被膜耐藥性都有影響，目前認為白色念珠菌生物被膜高耐藥性是由多因素共同作用導致。

    3.1 細胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）阻礙藥物滲入

    ECM是念珠菌分泌的多糖、蛋白質(zhì)及其他成分在白色念珠菌生物被膜的外表面形成的水凝膠樣結構。Thurnheer等[6]利用熒光探針發(fā)現這種細胞外基質(zhì)在生物被膜外形成的是高度迂曲孔道樣的結構，可能是阻止或延遲某些分子直徑較大的物質(zhì)滲入的原因。有實(shí)驗證實(shí)，從生物被膜中衍生出的游離菌體同樣會(huì )具有耐藥性，其程度卻低于其在生物被膜內的耐藥性。由于在流動(dòng)介質(zhì)中培養的生物被膜產(chǎn)生的ECM要明顯高于靜止介質(zhì)，但白色念珠菌生物被膜在以上兩種培養條件下，對抗真菌藥物敏感性沒(méi)有顯著(zhù)差異，提示ECM產(chǎn)生的多少與白色念珠菌生物被膜耐藥相關(guān)性不大。因此，生物被膜中的ECM有阻礙或延緩藥物滲入生物被膜的作用，但是這也并不是白色念珠菌耐藥的關(guān)鍵，其中還必有其他機制參與作用。

    3.2 生物被膜內細胞生長(cháng)減慢

    由于藥物效力通常和細胞生長(cháng)力密切相關(guān)，生長(cháng)旺盛的細胞對藥物的吸收更多更快，而生物被膜內的細胞由于營(yíng)養受限，生長(cháng)減緩，導致了真菌代謝降低，故對抗真菌藥物敏感性降低。Chandra等發(fā)現不同生長(cháng)速率的白色念珠菌生物被膜耐藥性伴隨著(zhù)生物被膜的發(fā)育成熟過(guò)程呈進(jìn)行性增加，最終高度耐藥。而原本就是游離狀態(tài)的白色念珠菌只有在低生長(cháng)速率下才能達到生物被膜的高度耐藥，但從生物被膜中衍生出的游離菌株耐藥性要高于原本游離狀態(tài)的菌株。這也說(shuō)明生長(cháng)速率只是造成耐藥性的因素之一。

    3.3 生物被膜內細胞質(zhì)膜的脂質(zhì)成分影響

    在這方面目前研究較多的是麥角甾醇。Kohli等發(fā)現，游離狀態(tài)的白色念珠菌隨著(zhù)耐藥性增加，細胞膜的麥角甾醇含量有所降低，質(zhì)膜的流動(dòng)性也隨之遞減。Mukherjee等也在實(shí)驗中觀(guān)察到，生物被膜的麥角甾醇水平成熟期減少了50%，改變遠大于游離狀態(tài)菌株，而成熟期恰是白色念珠菌生物被膜耐藥性大大提升的時(shí)期，故麥角甾醇改變很可能會(huì )影響耐藥程度。

    3.4 生物被膜耐藥基因的表達

    除了通過(guò)降低細胞膜的通透性減少藥物進(jìn)入細胞內，增加細胞內的藥物外排也可減少菌體對藥物的吸收，而藥物外排增強目前更被認為是主要原因。白色念珠菌生物被膜的外排泵除吸收營(yíng)養物質(zhì)、排泄代謝產(chǎn)物、傳導細胞間及細胞與外界信號外，在排出胞內藥物上也起了極大作用，此機制由多藥耐藥（multidrugresistance，MDR）蛋白介導。MDR蛋白包括ATP結合轉運蛋白及易化擴散載體超家族兩種類(lèi)型。ATP結合轉運蛋白家族中的念珠菌耐藥基因1（Candidadrugresistance1，CDR1）、CDR2及MDR1已被證實(shí)與游離狀態(tài)的白色念珠菌耐藥性密切相關(guān)。CDR1、CDR2和MDR1的過(guò)度表達是游離態(tài)白色念珠菌對唑類(lèi)藥物耐藥的重要原因之一，CDR1及CDR2增加藥物的外排，MDR1抑制藥物攝入，從而降低細胞內藥物濃度。但Mukherjee等利用基因敲除對比了生物被膜在3個(gè)時(shí)期中這3個(gè)基因的mRNA的表達水平及表達產(chǎn)物的功能活性，結果證實(shí)在中期和成熟期它們均有表達和產(chǎn)生外排藥物的活性，且均強于早期。這與耐藥性的變化不一致，提示這3個(gè)基因很可能只在早期的生物被膜的耐藥中起作用，而成熟生物被膜的耐藥機制目前仍不是很清楚。同時(shí)，用RNA印跡技術(shù)分析游離白色念珠菌細胞和生物被膜細胞顯示在生物被膜上有不同于游離菌株的基因表達。這些提示其耐藥性可能與某些基因表達有關(guān)。Lafleur等在實(shí)驗中發(fā)現對兩性霉素B及洗必泰分別及聯(lián)合耐藥的白色念珠菌耐藥株僅存在于生物被膜狀態(tài)，并且，這些耐藥株再接種后可再次對藥物敏感，提示其耐藥性并非突變而與表型變異有關(guān)。

    3.5 其他

    白色念珠菌生物被膜的耐藥機制還和原始耐藥株存在、對抗機體免疫機制、微環(huán)境變化等多種因素相關(guān)。各種因素在耐藥機制中都發(fā)揮作用，但這些都不是惟一的，而可能是多因素協(xié)同作用所致。目前這方面的研究仍然存在很多問(wèn)題，有待進(jìn)一步深入研究。

    4.展望

    綜上所述，白色念珠菌生物被膜的高度耐藥性使治療變得相當棘手，有時(shí)必須移除生物被膜定植的植入物，藥物治療才有效，但植入物的移除或更換，可能對患者造成更大的傷害甚至生命危險，也加重了其經(jīng)濟負擔。因此很多學(xué)者開(kāi)始探尋治療的新途徑：在藥物方面開(kāi)發(fā)出了如脂質(zhì)體形式的兩性霉素B及棘球白素或在原有抗真菌藥物基礎上聯(lián)合其它藥物；在生物醫學(xué)材料的改良方面，表面用6%的聚氧化乙烯修飾的聚醚氨基甲酸乙酯及用低能的表面聲波對阻止生物被膜形成有一定作用。這些都需要我們經(jīng)過(guò)更多的體內外實(shí)驗繼續探索解決的最佳方法，同時(shí)，進(jìn)一步研究生物被膜耐藥機制以尋求治療之本也還有很長(cháng)的道路需要探索。