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    作者：張丹鳳  潘崚

    作者單位：四川大學(xué)華西醫院血液科

    急性髓系白血病（AML）是一組基因改變導致的造血干細胞克隆性增殖失調的異質(zhì)性疾病。盡管根據細胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和臨床表現等特征進(jìn)行分層治療可以提高年輕AML患者的治療效果，但是老年AML患者的總體生存率仍然較差。最近幾年，新一代測序技術(shù)已經(jīng)證實(shí)在大部分AML患者中編碼參與轉錄表觀(guān)調節蛋白的基因頻發(fā)突變，這促使人們對AML患者的表觀(guān)基因組有了新的認識，并使針對表觀(guān)突變基因的靶向治療成為可能。現就2014年第56屆美國血液學(xué)會(huì )（ASH）年會(huì )關(guān)于A(yíng)ML常見(jiàn)的表觀(guān)遺傳學(xué)基因突變及其重要作用、表觀(guān)突變基因潛在的治療靶點(diǎn)和去甲基化藥物的臨床應用等內容進(jìn)行綜述。

    1、AML和相關(guān)表觀(guān)遺傳學(xué)異常概述

    AML以分化受損、克隆性增殖、原始粒細胞聚積和臨床癥狀急進(jìn)性加重為特征，是成年人中最常見(jiàn)的急性白血病。2014年美國新發(fā)病例為19000例，中位發(fā)病年齡為67歲。AML的預后與患者年齡、細胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)異常以及一系列臨床因素相關(guān)。最近幾年，對預后有顯著(zhù)影響的基因突變重新界定了危險度分層，但是治療選擇性有限，總體預后仍然較差，大于60歲的AML患者平均5年生存率小于10%.

    目前，治療AML最有效的方法是異基因造血干細胞移植，但是，即使運用減低劑量的預處理方案和顯著(zhù)優(yōu)化的輔助支持技術(shù)，異基因造血干細胞移植仍然只能被用于小部分初次緩解或者二次緩解的患者，以及更少一部分初次難以緩解的患者。盡管進(jìn)行了多種新藥的臨床試驗，但并沒(méi)有突破蒽環(huán)類(lèi)藥物聯(lián)合阿糖胞苷的經(jīng)典“3+7”方案的有效性。減低劑量的誘導化療方案為不能耐受標準化療方案的患者提供了可選擇的治療手段，但也大大降低了完全緩解（CR）率，對復發(fā)性AML更缺乏有效的治療措施。

    近年檢測技術(shù)的**性進(jìn)步使人們對AML的發(fā)病機制有了全新的認識。體細胞基因突變的全基因組和外顯子測序技術(shù)已經(jīng)證實(shí)，在大于70%的AML患者中編碼參與表觀(guān)遺傳學(xué)調控蛋白質(zhì)的基因頻發(fā)突變。表觀(guān)遺傳學(xué)調控包括DNA胞嘧啶殘基的修飾和翻譯后組蛋白乙酰化改變，其對基因的選擇性表達和正常細胞向惡性腫瘤的轉化起決定性作用。

    最重要的是，表觀(guān)遺傳學(xué)修飾是可遺傳、動(dòng)態(tài)的和可逆的，但不引起DNA序列發(fā)生改變。頻發(fā)突變的表觀(guān)遺傳學(xué)修飾基因包括DNMT3A（DNAnucleotide methyltransferase 3A）、TET2（ten-eleven translocation 2）、IDH1/IDH2 （isocitrate dehydrogenase 1/2）、ASXL1（the addition of sex comds like 1）和MLL1 （mixed lineage leukemia 1）。這些基因突變影響造血細胞的自我更新和（或）分化，并促使向髓系轉化，但還不足以導致白血病形成。

    2、AML常見(jiàn)的DNA甲基化和組蛋白修飾異常

    2.1 DNA甲基化相關(guān)基因異常

    2.1.1 DNMT3A 突變

    DNA甲基化是表觀(guān)遺傳調節的重要組成部分，通常參與轉錄沉默。已經(jīng)證實(shí)，在A(yíng)ML中DNA高甲基化并促使一些腫瘤抑制基因發(fā)生轉錄抑制，通過(guò)增殖和分化等調控異常促使白血病形成。骨髓增生異常綜合征（MDS）的DNA甲基化數據分析顯示腫瘤抑制基因的異常甲基化可能在MDS向AML轉化的發(fā)病機制中占主導地位。DNA甲基轉移酶（DNMT）催化胞嘧啶第5位碳原子殘基甲基化，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶（5-mC），甲基化的胞嘧啶多位于啟動(dòng)子胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（CpG）島上。與甲基化的DNA相結合的蛋白質(zhì)可以識別甲基化的CpG島的二核苷酸序列，并促進(jìn)招募染色質(zhì)重塑蛋白和組蛋白修飾酶，例如組蛋白去乙酰化酶（HDAC）和組蛋白甲基轉移酶（HMT）。

    DNMT3A作為半甲基化模板促成基因組DNA甲基化，DNMT1則維持完整的甲基化。這一過(guò)程構成了顯著(zhù)的、可遺傳的DNA甲基化模式，有助于辨別AML亞型、判斷預后和作為預測治療反應的生物指標。AML可以整體上呈現低甲基化或高甲基化，提示表觀(guān)遺傳路徑的高甲基化或低甲基化在白血病生成中都有重要作用。最近的數據提示DNMT1在白血病干細胞（LSC）中維持DNA甲基化模式，并且是LSC自我更新的必要條件。DNMT3A已經(jīng)被證實(shí)在造血干細胞自我更新和分化中起關(guān)鍵作用。重要的是，在細胞遺傳學(xué)正常的AML中，體細胞DNMT3A功能缺失性突變的發(fā)生率大于30%,其可能與較差的臨床預后相關(guān)。但AML中DNMT3A基因突變對DNA胞嘧啶甲基化和轉錄的影響尚不明確，而且單獨的DNMT3A功能缺失不足以導致白血病的發(fā)生。大部分突變都涉及882位精氨酸的雜合替換，體外研究顯示這種替換降低甲基轉移酶活性。

    2.1.2 TET2基因突變

    TET雙加氧酶家族通過(guò)催化5-mC向5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）轉化而調控DNA甲基化，進(jìn)一步阻止能夠識別甲基化DNA的蛋白質(zhì)間的結合，這是DNA脫甲基的關(guān)鍵步驟。TET2功能缺失性突變在細胞遺傳學(xué)正常的AML患者中發(fā)生率約為10%,并且和較差的總體生存率密切相關(guān)。TET2基因敲除的小鼠造血干細胞過(guò)度自我更新，并發(fā)展成類(lèi)似慢粒單核細胞白血病的髓系惡性腫瘤，但是單獨的TET2突變尚足以導致AML.

    2.1.3 IDH1 和IDH2 突變

    DNA甲基化與同源二聚體酶IDH1和IDH2（IDH1 /2）催化的檸檬酸鹽代謝密切相關(guān)，IDH1/2 催化異檸檬酸鹽氧化脫羧為α-酮戊二酸（α-KG）。IDH1 /2獲得性功能突變在細胞遺傳學(xué)正常的AML 中發(fā)生率為10%——30 %,其突變導致酶功能異常，促使α-KG產(chǎn)生減少、2-羥戊二酸（2-HG）產(chǎn)生增加。不論是TET2還是含有JmjC結構域的組蛋白賴(lài)氨酸脫甲基酶，其功能的發(fā)揮都依賴(lài)α-KG,IDH1/2突變和2-HG積聚會(huì )導致其功能受損，進(jìn)而導致DNA和組蛋白高甲基化。IDH1/2突變對AML預后影響的研究結論尚不統一，可能是由于突變的位點(diǎn)不一樣和（或）伴隨突變不同。例如：IDH2的第140位精氨酸殘基發(fā)生突變以及細胞遺傳學(xué)正常的AML患者發(fā)生NPM1和IDH1或IDH2突變時(shí)提示預后良好，在大樣本隨機試驗中顯示3年總生存率為89%.值得注意的是IDH1 /2和TET2突變是互相排斥的，但是具有這兩種明顯不同突變的AML患者具有相似的甲基化過(guò)程。

    2.2 組蛋白修飾異常

    2.2.1 MLL 突變

    位于染色體11q23的MLL基因編碼H3K4甲基轉移酶（HMT），HMT參與組蛋白重塑，影響HOX基因和Wnt信號通路。MLL框架內部分串聯(lián)重復在初發(fā)AML中發(fā)生率為5%-7%,提示預后不良，若同時(shí)具有嗜親性病毒整合基因l（EVI1）表達異常時(shí)預后更差。MLL區域是染色體易位和重排的高發(fā)區域，產(chǎn)生多種融合蛋白，其中有一部分是致腫瘤性的。MLL融合蛋白直接和一些包括HMT D0T1L的表觀(guān)修飾因子相互影響。HMTD0T1L能夠催化H3K79甲基化，相關(guān)研究提示MLL融合蛋白和DOT1L的相互作用可促使白血病發(fā)生。

    2.2.2 ASXL1 突變

    多梳相關(guān)基因ASXL1通過(guò)與多梳抑制復合物（PRC2）相結合調控表觀(guān)遺傳基因。PRC2通過(guò)使組蛋白3在第27位賴(lài)氨酸殘基發(fā)生三甲基化（H3K27me3）來(lái)介導相關(guān)基因的轉錄抑制。ASXL1突變導致ASXL1蛋白表達缺失，降低H3K27甲基化，并減少PRC2與AML發(fā)病可能相關(guān)的基因結合，導致對這些基因的抑制作用減弱。在A(yíng)ML患者中，ASXL1功能缺失性突變的發(fā)生率為6%-30 %,多發(fā)生于老年、MDS轉化的AML患者中，提示預后不良。

    3、針對表觀(guān)遺傳學(xué)異常的靶向治療

    3.1 DNMT抑制劑

    目前美國食品與藥品管理局（FDA）已批準了兩種DNMT抑制劑：阿扎胞苷及其脫氧衍生物地西他濱。這兩種胞嘧啶類(lèi)似物在20世紀60年**發(fā)，低劑量可抑制DNMT;大劑量地西他濱整合入DNA,大劑量阿扎胞苷整合入DNA和RNA,但具體機制仍不清楚。這兩種藥物均被批準用于治療MDS,但基于幾個(gè)相關(guān)的臨床試驗結果，也已經(jīng)用于A(yíng)ML的治療。

    在一項多中心II期臨床研究中，共入組227例新診斷的AML患者，在72h內靜脈滴注地西他濱 135 mg / m2,每6周重復一次為1個(gè)療程，最多用4個(gè)療程。部分患者在第2個(gè)療程接受了全反式維甲酸治療，和（或）每4——6周連續3d給予地西他濱每天20 mg/m2維持治療。不論染色體核型如何，總反應率為26%,中位生存期為5.5個(gè)月，1年生存率為28%.

    在另外一個(gè)多中心II期研究中，共入組55例AML患者，入組標準為骨髓原始細胞大于20%和年齡大于60歲，地西他濱用量為每天20 mg/m2,連續靜脈滴注5d,間隔4周重復一次，CR率為24%,中位生存期為7.7個(gè)月。在細胞遺傳學(xué)提示預后差的AML患者以及有白血病前期病變的AML患者中有較好的治療反應。

    在另一項III期隨機臨床試驗中，比較了上述相同劑量的地西他濱方案和單純維持治療以及小劑量阿糖胞苷方案的療效，顯示地西他濱組的CR率為17.8%,對照組為7.8%,總生存無(wú)明顯獲益，但隨后的計劃外數據分析顯示地西他濱組的生存獲益具有統計學(xué)意義，這一結果促使歐洲藥品管理局批準地西他濱用于A(yíng)ML的治療。Scandura等報道，地西他濱每天20 mg/m2,連續應用5d 作為表觀(guān)遺傳學(xué)預激方案，在傳統的柔紅霉素聯(lián)合阿糖胞苷誘導治療前使用取得了較好療效。目前，一項標準的DA誘導方案聯(lián)合或不聯(lián)合地西他濱預激方案的II期隨機臨床試驗正在進(jìn)行中。

    在美國進(jìn)行的一項阿扎胞苷治療高危MDS（包括骨髓原始細胞比例為20%——30%、按WHO診斷標準診斷為AML的臨床試驗中，阿扎胞苷以每天75 mg/m2 的劑量連續7d皮下注射，28 d為1個(gè)療程；對照組為傳統治療方案，包括最好的支持治療、低劑量阿糖胞苷或大劑量化療。雖然阿扎胞苷的CR率僅為18%、對照組為16%,但阿扎胞苷組有明顯的生存獲益。在次要結束終點(diǎn)如輸血需求、靜脈應用抗生素和住院天數等方面，阿扎胞苷治療組也有改善。

    在法國，給予149例初發(fā)老年AML患者相同劑量和周期的阿扎胞苷，結果總反應率為33%,取得CR或者CR但血小板不完全恢復者為23%,總生存期為9.4個(gè)月。意大利一個(gè)小型研究顯示，35例初治AML患者應用相同劑量和周期的阿扎胞苷治療后取得相似的療效，CR率為31%,總生存期為9個(gè)月。和地西他濱治療一樣，大多數對阿扎胞苷治療有反應的AML患者，繼續接受阿扎胞苷維持治療，直到出現病情進(jìn)展或不可耐受的毒性反應。在A(yíng)ML強化誘導化療和異基因造血干細胞移植之后，使用阿扎胞苷維持治療能夠降低或推遲復發(fā)。

    3.2 HDAC抑制劑

    單獨應用HDAC抑制劑治療MDS和AML表現出有限的臨床價(jià)值，但是聯(lián)合應用DNMT抑制劑通過(guò)解除轉錄抑制顯示出協(xié)同效果。多種HDAC抑制劑，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立諾他等聯(lián)合阿扎胞苷或地西他濱的臨床試驗正在進(jìn)行，但是目前的結果令人失望。例如：Entinostat聯(lián)合阿扎胞苷治療149例MDS和AML的II期隨機試驗結果顯示并沒(méi)有提高反應率。值得注意的是，在這個(gè)試驗中這兩種藥物是同時(shí)應用的，而體外實(shí)驗顯示先給予DNMT抑制劑再序貫給予HDAC抑制劑才能達到最佳的協(xié)同作用。Entinostat是強效細胞周期抑制劑，可能阻止阿扎胞苷的整合，導致初始去甲基化作用減弱。

    3.3 IDH1/2抑制劑

    針對IDH1/ 2突變酶的小分子靶向抑制劑治療攜帶IDH1 / 2突變的AML患者的早期臨床試驗正在進(jìn)行中。此抑制劑可以減少2-HG的產(chǎn)生，誘導H3K9me3去甲基化，增加有關(guān)分化基因的表達。

    3.4 DOT1L蛋白甲基轉移酶抑制劑

    相關(guān)研究已證實(shí)D0T1LHMT的酶活性可促使有 MLL重排的個(gè)體產(chǎn)生白血病。D0T1L抑制劑可以降低H3K79甲基化和MLL融合靶向基因表達。一個(gè)強效、高度選擇性的D0T1L抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗。強效選擇性HMTEZH2抑制劑也正在研發(fā)中。

    3.5 賴(lài)氨酸乙酰化抑制劑

    結構域蛋白質(zhì)能夠識別蛋白末端的賴(lài)氨酸殘基，這一過(guò)程可被小分子抑制劑所阻止。幾種BET抑制劑臨床試驗正在進(jìn)行中，研究結果顯示其能夠阻止白血病細胞、干細胞和祖細胞增殖，阻斷MLL介導的白血病轉化。

    3.6 賴(lài)氨酸去甲基酶抑制劑

    在體外實(shí)驗中，KDM1A/***1抑制劑可有效對抗白血病細胞系和原代白血病細胞，特別是與HDAC抑制劑和全反式維甲酸聯(lián)合使用時(shí)作用更為顯著(zhù)。盡管體外實(shí)驗顯示KDM1A/***1抑制劑對MLL白血病最效，AML 的其它亞型以及其它髓系惡性腫瘤對其也比較敏感。目前KDM1A/***1抑制劑治療AML和MDS的臨床試驗正在進(jìn)行中。

    4、靶向表觀(guān)遺傳學(xué)異常所面臨的挑戰

    4.1 治療把點(diǎn)的選擇

    AML 是由一系列異常因素引起的疾病，疾病本身存在的多種異常可以成為治療的靶點(diǎn)，包括表觀(guān)遺傳通路失調控、基因突變、細胞表面標志、信號轉導通路、LSC和骨髓微環(huán)境等。最近對AML克隆構型的研究發(fā)現，AML克隆異質(zhì)性隨著(zhù)疾病的進(jìn)展和復發(fā)而變化，使得AML的治療靶點(diǎn)具有移動(dòng)性和多變性，在疾病的不同階段治療靶點(diǎn)不同。例如不同的初發(fā)AML患者的LSC、原始細胞和干細胞具有遺傳學(xué)和表觀(guān)遺傳學(xué)的異質(zhì)性，化療后存活下來(lái)的白血病細胞的克隆性會(huì )發(fā)生變化。用全基因組捕獲測序技術(shù)研究初發(fā)AML標本的克隆構型，發(fā)現從遺傳學(xué)角度定義的亞克隆和LSC之間有明顯的功能異質(zhì)性。因此靶向治療的關(guān)鍵是如何識別并根除所有的克隆，而不是通過(guò)高度選擇的單向靶點(diǎn)來(lái)消除優(yōu)勢克隆。

    4.2 治療人群的選擇

    治療人群的選擇是一個(gè)復雜但是絕對關(guān)鍵的問(wèn)題。可以把AML分為很多亞組，但每種分類(lèi)法都有優(yōu)勢和劣勢。比如可以根據年齡把AML患者分為小于60歲的年輕患者和大于60歲的老年患者。這種武斷的分類(lèi)往往只是為了界定患者能否耐受大劑量化療，然而隨著(zhù)支持治療的進(jìn)展和“老年人”體能狀態(tài)的改善，越來(lái)越證明不能單憑年齡指導治療方案的選擇。不過(guò)年齡仍然是重要的預后因子，臨床醫生以及管理部門(mén)已經(jīng)習慣于根據年齡分組來(lái)判定某種新治療措施的有效性。因此，在一個(gè)耐受良好、能夠消除年齡影響的“魔幻***”出現之前，年齡仍將會(huì )是影響AML臨床試驗的一個(gè)重要參考因素。

    也可以按預后對AML進(jìn)行分類(lèi)。一種新藥的早期臨床試驗往往是在復發(fā)難治的患者中進(jìn)行，但這又是一種令人沮喪的模式，因為有些新藥很難在復發(fā)難治的AML患者中顯示出療效，并由此退出進(jìn)一步的研究。由于復發(fā)難治的AML在生物學(xué)上和臨床上明顯不同于初治AML,因此新藥的研究應該在初治患者中進(jìn)行。新診斷的接受標準方案治療的AML患者可以用包細胞遺傳、分子遺傳學(xué)和表觀(guān)遺傳學(xué)進(jìn)行危險度分層、判定其預后。一項研究顯示七個(gè)基因在不同甲基化區域有高水平甲基化，但表達水平減低是***于年齡的臨床預后良好的因子。因此，那些新診斷的、用常規方案治療預后可能較差的患者應該是臨試驗的受試對象。

    理想的涉及表觀(guān)遺傳學(xué)異常的靶向治療的臨床試驗，應該通過(guò)預測性生物學(xué)指標選擇臨床試驗受試者，聯(lián)合應用相應的表觀(guān)修飾藥物進(jìn)行治療。但實(shí)際上絕不是如此簡(jiǎn)單。例如盡管已知氮雜核苷抑制DNMT,但是并不清楚其有效性與這種作用機制相關(guān)的程度如何，而且，直到目前應用甲基化模式去預測反應率或指導治療都沒(méi)有成功。不過(guò)，攜帶DNMT3A突變的AML患者對地西他濱有良好的反應。

    如何選擇患者群體也是個(gè)難題。如果根據白血病生物學(xué)特點(diǎn)的假設選擇了“特定”的患者亞群參加臨床試驗，患者的獲益具有挑戰性，但可能錯失了一些因為不確定因素未能入組但對藥物可能有良好反應的患者。另一方面，如果對沒(méi)有選擇的AML患者給予精準靶向藥物治療，可能觀(guān)察不到靶向藥物的獲益，除非受試人群碰巧具有藥物作用靶點(diǎn)。

    4.3 治療時(shí)機的選擇

    AML治療包括誘導、鞏固和緩解后治療。盡管氮雜核苷可以適當提高AML的總生存率，但沒(méi)有CR獲益。作為治療目標應該保留CR這一試驗終點(diǎn)，因為CR與患者的總生存和生活質(zhì)量密切相關(guān)。

    因為針對表觀(guān)遺傳異常的靶向藥物與其他藥物合用要比單用能產(chǎn)生更大的獲益，所以已經(jīng)考慮在傳統的“基石誘導方案”基礎上添加試驗新藥。例如：英國醫學(xué)研究委員會(huì )確定了小劑量阿糖胞苷作為老年AML的標準誘導方案，在基石方案中添加針對表觀(guān)遺傳學(xué)調控的新藥的臨床試驗正在進(jìn)行中，稱(chēng)為“Pick-A-Winner”計劃。因為DNMT抑制刺聯(lián)合其他表觀(guān)抑制劑可能達到更好的療效，美國已考慮阿扎胞苷75 mg/m2 x 7 d聯(lián)合地西他濱20 mg/m2 x 10d 作為AML患者標準誘導治療方案，對于不能耐受大劑量化療的老年AML患者也可以釆取上述聯(lián)合誘導方案。

    鑒于至今沒(méi)有更強烈的化療方案優(yōu)于阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類(lèi)藥物的“7+3”方案，此方案應作為誘導緩解方案的基石，新藥可以加入到“7+3”方案中或作為單藥評估療效，參加臨床試驗的初治患者隨機接受三種方案中的一種進(jìn)行治療。這樣就可以通過(guò)消除不必要的生物異質(zhì)獲得“真實(shí)世界”      的誘導緩解治療。

    不管用何種藥物誘導治療，誘導后殘余的白血病細胞不同于在生物治療之前。因此，目前重復同一化療方案進(jìn)行鞏固治療是不恰當的。在化療后或移植后釆用表觀(guān)遺傳學(xué)靶向治療有可能控制緩解后的白血病克隆演變。迄今為止，這些靶向表觀(guān)遺傳學(xué)的復合物大部分都是非細胞毒藥物，因此更適用于白血病負荷低的疾病狀態(tài)，此觀(guān)點(diǎn)尚需大樣本AML患者參與的臨床試驗來(lái)證實(shí)。

    4.4 有效性的評定

    針對表觀(guān)遺傳學(xué)異常的靶向治療可能需要長(cháng)期監測療效，往往需要數周或數月才能顯示療效。例如DNMT抑制劑治療后數月才能觀(guān)察到完全緩解，而基于標準的形態(tài)學(xué)、免疫表型的評價(jià)標準可能不足以評價(jià)這些藥物的療效。目前人們正在努力嘗試通過(guò)DNA甲基化特征、基因表達譜、質(zhì)譜分析法和其他技術(shù)來(lái)尋找可以預測療效、監測疾病的生物學(xué)標志。

    4.5 聯(lián)合治療

    盡管阿扎胞苷和地西他濱單藥治療AML的療效是毋庸置疑的，但關(guān)于這類(lèi)藥物的最佳劑量、周期、聯(lián)合模式和持續時(shí)間等都尚待摸索，多種小規模、單藥、單機構的I期和II期研究不足以明確回答這些問(wèn)題。許多研究藥物如HDAC抑制劑和溴結構域蛋白抑制劑的聯(lián)合應用有望施于臨床試驗。

    5、小結

    對AML表觀(guān)遺傳修飾基因重現性突變的認識揭示了表觀(guān)遺傳學(xué)在A(yíng)ML生物學(xué)方面的關(guān)鍵性和復雜性作用，已經(jīng)啟動(dòng)了針對表觀(guān)遺傳學(xué)異常的靶向治療。但是，AML生物學(xué)和AML患者的高度異質(zhì)性使表觀(guān)遺傳學(xué)靶向治療面臨嚴峻的挑戰。尚需有更多的臨床醫生和患者自愿參加、有相關(guān)基礎研究支持、合理的臨床試驗來(lái)證實(shí)表觀(guān)遺傳學(xué)靶向治療的療效。