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    國內外臨床試驗研究

    胎兒染色體非整倍體異常的無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前檢測（NIPT）得益于新一代高通量測序技術(shù)的發(fā)展，國內外研究人員進(jìn)行了大量的臨床試驗進(jìn)一步探討該技術(shù)在產(chǎn)前檢測中的應用。

    2008年有兩個(gè)不同的海外研究小組（Chiu等人。 2008; Fan等人。 2008）采用大規模平行測序技術(shù)（MPS）在妊娠21三體綜合征胎兒的孕婦的外周血中發(fā)現了超量的21號染色體。隨后，又相繼發(fā)表三個(gè)臨床試驗，再次驗證了大規模平行測序（MPS）對染色體非整倍體的檢出具有高靈敏度和特異性（見(jiàn)表1）。于是，從2011年年底開(kāi)始，美國產(chǎn)前臨床界開(kāi)始利用NIPT對高危孕婦進(jìn)行檢測。Palomaki等人（2011）的研究驗證了MPS對高危妊娠母體血漿胎兒T21的檢測擁有近99%的靈敏度和特異性，這里定義高危妊娠因素包括產(chǎn)婦年齡、家族病史，血清學(xué)篩查高危和超聲篩查高危。隨后該小組（Palomaki等，2012），又發(fā)表一項研究顯示MPS對T18檢測的靈敏度為100%,假陽(yáng)性率為0.28%,對T13檢測的靈敏度為91.7%,假陽(yáng)性率為0.97%.針對T13、T18和T21檢測的復合靈敏度為98.9%,復合假陽(yáng)性率為1.4%.Bianchi等人（2012）也采用MPS對高危妊娠孕婦的血清進(jìn)行檢測，但算法分析稍有不同。在這項研究中，NIPT針對T21、T18和T13檢測的靈敏度分別為100%、97.2%、78.6%;特異性皆為100%.他們還報道了NIPT也能檢測出其他染色體非整倍體，也包括易位型三體以及嵌合型三體。特別是，對X染色體單體檢測的靈敏度為93.8%,特異性為99.8%.此外，Bianchi等人同時(shí)認為NIPT在不久的將來(lái)也可對其他染色體異常進(jìn)行篩查。Mazloom等人很快就進(jìn)一步證實(shí)了這一觀(guān)點(diǎn)，他們在基于MPS技術(shù)的基礎上，通過(guò)構建針對性染色體的分類(lèi)算法，對包括[47,XXX], [45,X], [47,XXY], and [47,XYY]在內的幾大性染色體綜合征進(jìn)行檢測，其結果的復合靈敏度為96.2%,特異性為0.3%.這一結果提示無(wú)創(chuàng )檢測技術(shù)對特納綜合征、XYY、克氏綜合癥的檢測精確度接近常染色體，可以考慮將其應用于臨床。

    另外一些研究人員采用選擇性的染色體分析方法。該方法是對母體血漿游離DNA的特定的染色體區域進(jìn)行測序（Sparks等人，2012）。最近發(fā)表了一項多中心合作的臨床研究，針對接受CVS或羊水穿刺術(shù)的孕婦人群，采用染色體選擇性的測序方法對T21和T18進(jìn)行檢測。（Norton等，2012）（見(jiàn)表1）。利用選定區域數字化分析（DANSR）方法以及FORTE算法進(jìn)行風(fēng)險評估，預設cut-off值為1%進(jìn)行高風(fēng)險與低風(fēng)險的界定。結果顯示對T21檢出的靈敏度和特異性分別為100%和99.97%. T18的靈敏度和特異性分別為97.4%和99.93%.隨后又發(fā)表的一篇文章（Ashoor等人，2012）表明使用DANSR和FORTE方法在一項回顧性的病例對照研究中，對T13檢測的靈敏度和特異性分別為80%和99.95%.Zimmermann（2012）通過(guò)對166例樣本的染色體多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行選擇性的測序分析，并使用MATLAB （MathWorks, Natick, MA, USA） 實(shí)驗室提供統的計算方法對染色體拷貝數進(jìn)行分類(lèi)計算，其復合計算精度達到了99.8%,除一例45X因DNA質(zhì)量問(wèn)題沒(méi)能檢測到，其余的19例染色體非整倍體達到了100%的靈敏度和特異性。

    這些研究證實(shí)NIPT在高風(fēng)險孕婦人群中，針對T21、T13、T18的檢測是一種可靠的方法。

    同樣針對該項技術(shù)，國內也進(jìn)行了兩期大規模臨床試驗。梁德生等人（2013）的一項412份有效樣本的回顧性臨床試驗，針對唐氏綜合征高危孕婦采用MPS進(jìn)行NIPT檢測，結果顯示對T21、T18、T13復合檢測靈敏度為100%,復合檢測特異性高于99.7%.同時(shí)，結果也印證了通過(guò)一次檢測可同時(shí)對全部染色體非整倍體進(jìn)行觀(guān)察。另外一項更大規模的前瞻性的臨床試驗收集了超過(guò)2000份孕婦血漿（宋義軍等，2013），同樣采用MPS對T21、T18、T13進(jìn)行檢測，檢出率為100%,假陽(yáng)性率為0.05%.這項研究中低于35歲的非高齡孕婦都有血清學(xué)篩查結果作為對照，不僅證實(shí)NIPT擁有遠高于傳統血清學(xué)篩查的靈敏度和特異性，更進(jìn)一步驗證NIPT未來(lái)在中等風(fēng)險及低風(fēng)險孕婦人群的應用。來(lái)自**的一項多中心合作研究顯示（Shaw等，2013），在100例極高危孕婦群體中，除一例45X由于DNA含量不足未能識別外，其余染色體非整倍體全部檢出，復合檢出率出為96.4%,而對低危組群的201例樣本未發(fā)現染色體異常，結果證實(shí)特異性為100%.

    不謀而和的是，國際研究也表明NIPT在中等風(fēng)險人群中應該具有類(lèi)似的靈敏度和特異性（Nicolaides等人，2012），這預示著(zhù)隨著(zhù)越來(lái)越多臨床數據的積累，未來(lái)NIPT可以覆蓋到中等風(fēng)險孕婦人群（Norton等，2012）。

    隨著(zhù)NIPT 在臨床的大規模實(shí)踐，科學(xué)小組展開(kāi)了越來(lái)越多細致深入的研究，Futch（2013年）等人最近總結了2012年2月-7月間5974例臨床樣本的檢測結果（見(jiàn)表1），并對可能影響檢測結果的生物相關(guān)因素做了討論，研究認為，胎盤(pán)嵌合，母體的惡性腫瘤，母親嵌合體，雙胞胎中一胎停育等情況都應考慮到基因組測序的過(guò)程當中，并建立起一套無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前檢測的臨床性能參數。此外，孕周和DNA在母血中的百分含量也是影響檢測結果的重要因素，Wang等人（2013）對22,384份樣本分析發(fā)現，母血漿中胎兒DNA含量與孕婦體重成反比，與孕周成正比，在10-21孕周間，胎兒DNA含量每周增加0.1%,超過(guò)21孕周時(shí)，DNA含量每周增加1%.在初次采血DNA含量不足的情況下，平均3.6周后再次采血，DNA含量有普遍提高。

    隨著(zhù)無(wú)創(chuàng )檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，人們逐漸在嘗試通過(guò)MPS方法對染色體結構異常進(jìn)行檢測，Srinivasan（2013）對11個(gè)經(jīng)過(guò)核型診斷的胎兒游離DNA進(jìn)行了分析。對每個(gè)樣本進(jìn)行了大約109個(gè)25堿基目標片段的測序分析。通過(guò)靶序列計算和歸一化處理，除四例嵌合體外，MPS發(fā)現了全部的7個(gè)缺失、重復、易位和20號染色體三體。其結果甚至好于核型分析。近期的報道也認為（Lau,2013），通過(guò)生物信息學(xué)方法的不斷改進(jìn)，基于MPS方法對胎兒染色體結構異常進(jìn)行檢測具有可行性。可以預見(jiàn)，無(wú)創(chuàng )產(chǎn)前檢測在不久的將來(lái)會(huì )有更為廣泛的臨床用途。

    國內外指導意見(jiàn)/專(zhuān)家共識

    雖然國內外臨床研究已十分廣泛的開(kāi)展，但迄今為止，專(zhuān)業(yè)協(xié)會(huì )共識或關(guān)于NIPT的指導意見(jiàn)還為數不多。2012年ISPD發(fā)表聲明，在恰當的遺傳咨詢(xún)引導下，通過(guò)其他篩查方法、母親年齡或家族病史確定為高風(fēng)險的孕婦，可以進(jìn)行NIPT（benn等。2012A）。同年美國婦產(chǎn)科學(xué)會(huì )（ACOG）與美國母胎醫學(xué)會(huì )（SMFM）也共同發(fā)表委員會(huì )指導意見(jiàn)，推薦無(wú)創(chuàng )DNA產(chǎn)前檢測作為非整倍體高危人群的一種初篩檢測。學(xué)會(huì )同時(shí)詳細界定了非整倍體高危人群：1）母親年齡超過(guò)35歲；2）超聲結果顯示非整倍體高危；3）生育過(guò)三體患兒；4）早孕期，中孕期或三聯(lián)篩查、四聯(lián)篩查呈現非整倍體陽(yáng)性結果；5）父母為羅伯遜易位。

    面對NIPT迅猛發(fā)展帶給臨床遺傳咨詢(xún)的種種問(wèn)題，2013年1月美國國家遺傳咨詢(xún)師協(xié)會(huì )（NSGC）針對無(wú)創(chuàng )DNA產(chǎn)前檢測的遺傳咨詢(xún)發(fā)表指導意見(jiàn)。NSGC認為1）NIPT當前只作為產(chǎn)前染色體非整倍體評估的補充檢測，其結果不能視為診斷，異常結果必須通過(guò)有創(chuàng )性診斷確診；2）因缺乏在中低風(fēng)險人群中的臨床數據NIPT暫時(shí)不能替代現有的染色體非整體篩查方法；3）現有的臨床數據顯示NIPT只能涵蓋T21、T18、T13等，所以在孕婦檢測之前應對其說(shuō)明這項檢測的檢測范圍和局限性；4）需重視檢測前和檢測后的遺傳咨詢(xún)，并給出正確的咨詢(xún)意見(jiàn)；5）如果超聲檢查異常、家族有染色體異常病史、復發(fā)性流產(chǎn)、高齡、篩查陽(yáng)性等，無(wú)論其N(xiāo)IPT結果如何，都應對其進(jìn)行詳細的遺傳咨詢(xún)；6）NIPT發(fā)展迅速，臨床試驗如火如荼，NSGC也將根據NIPT的發(fā)展調整遺傳咨詢(xún)的指導意見(jiàn)。

    2013年4月，ISPD再次發(fā)表指導意見(jiàn)（Benn等，2013），在此前的基礎上結合最新的進(jìn)展與出現的問(wèn)題，提出一些新觀(guān)點(diǎn)。NIPT對性染色體的篩查率較低；當發(fā)生雙胎一胎早期流產(chǎn)時(shí)，結果將不準確；對于嵌合體（包括局限性胎盤(pán)嵌合體），結果將不準確。

    緊接著(zhù)同年4月，美國醫學(xué)遺傳學(xué)及基因組學(xué)學(xué)會(huì )（ACMG）在肯定NIPT極高的準確率和較低的假陽(yáng)性率的同時(shí)，也針對NIPT的局限性、遺傳咨詢(xún)及臨床標準發(fā)表聲明。

    國內衛計委全國產(chǎn)前診斷技術(shù)專(zhuān)家組也于2012年就無(wú)創(chuàng )DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)進(jìn)行了論證（邊旭明等人、2012），指出該檢測技術(shù)是一種"近似于診斷水平"、"目標疾病指向精確"的產(chǎn)前檢篩查新技術(shù)，應該與現行的產(chǎn)前篩查體系相結合，并準確把握臨床適用人群，包括1）有介入性產(chǎn)前診斷禁忌癥者（先兆流產(chǎn)、發(fā)熱、有出血傾向、感染未愈等）；2） 產(chǎn)前篩查高危或臨界高危孕婦（如風(fēng)險率在1/270-1/1000）；3） 珍貴兒，知情后拒絕介入性產(chǎn)前診斷的孕婦；4）對介入性產(chǎn)前診斷極度焦慮的孕婦；5）就診時(shí)處于較大孕周超出目前產(chǎn)前篩查范圍的孕婦。