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    作者：程亮

    非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%,外科手術(shù)是最有效的治療方法，但僅適用于NSCLC中的一小部分無(wú)或局限性轉移的患者，并且很多患者手術(shù)治療后仍會(huì )復發(fā)轉移。近年來(lái)表皮生長(cháng)因子受體（EGFR）在肺癌致瘤中的作用以及針對EGFR的靶向治療備受關(guān)注，病理學(xué)家在如何篩選合理的EGFR靶向治療對象及判定檢測結果中起著(zhù)關(guān)鍵的作用。本文總結了EGFR突變、基因拷貝數、EGFR過(guò)表達、磷酸化以及EGFR通路下游靶基因改變在預測NSCLC患者EGFR靶向治療療效最新研究成果。同時(shí)闡述了KRAS和BRAF突變以及ALK基因重排在肺癌靶向治療中的作用。

    一、EGFR概述

    EGFR及其家族成員通過(guò)調節細胞增生、凋亡、遷移及腫瘤血管生成發(fā)揮重要的致癌作用。EGFR信號分子改變涉及多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展。盡管EGFR突變通過(guò)何種信號途徑致癌的機制還不完全清楚，但明確的是EGFR突變能增強酪氨酸蛋白激酶活性。人類(lèi)癌癥相關(guān)體細胞突變目錄 （COSMIC）中提供了有關(guān)NSCLC有意義的基因突變及靶向治療耐藥相關(guān)的突變基因信息（COSMIC, <http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/add_***/>）。EGFR基因位于7號染色體短臂7p12區，全長(cháng)200kb,包含28個(gè)外顯子，是編碼464個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。它的活化依靠與其配體結合。配體一旦與EGFR結合，受體形成同源或異源二聚體，活化自身酪氨酸蛋白激酶。配體結合引起的受體二聚化可導致胞內酪氨酸殘基自身磷酸化，磷酸化是下游信號的關(guān)鍵分子事件。EGFR可以激活下游多種信號途徑，參與調節細胞增殖，分化，遷移以及存活（圖 1）。EGFR在許多實(shí)體腫瘤的生長(cháng)和存活中發(fā)揮著(zhù)重要作用。EGFR 突變影響EGFR活化及過(guò)表達，而導致腫瘤的發(fā)生。 EGFR受體酪氨酸激酶可以通過(guò)兩個(gè)信號通路調節細胞增殖與存活：PI3K/AKT/mTOR信號通路以及 RAS/RAF/MEK/MAPK信號通路。這些下游信號途徑參與調節細胞增殖、凋亡、遷移、存活等重要生理過(guò)程，也參與調節腫瘤血管生成及腫瘤形成（圖1）。

    基于EGFR 基因激酶域基因突變理論研制的針對EGFR酪氨酸激酶的靶向藥物治療給NSCLC患者帶來(lái)了新的治療契機。抗EGFR的靶向治療主要有兩種方式：EGFR單克隆抗體（如Cetuximab、Panitumumab）以及小分子EGFR酪氨酸激酶拮抗劑（EGFR-TKI）。大規模III期臨床試驗結果顯示臨床有效率15%到37.5%.臨床試驗表明多種有EGFR突變的腫瘤對EGFR-TKI敏感，臨床有效率10%-30%.應用最廣的EGFR-TKIs是吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）。這類(lèi)藥物是可逆性抑制劑，它們通過(guò)競爭ATP結合在EGFR-TK上的活化位點(diǎn)發(fā)揮作用， 主要用于鉑類(lèi)藥物化療失敗的病人 .已有222篇相關(guān)文獻證實(shí)EGFR 突變可預測晚期NSCLC患者EGFR-TKI單藥療效。

    圖 1: EGFR 及其信號通路 EGFR單體胞外段有兩個(gè)配體結合域：一個(gè)是跨膜親脂結構域和第18號到24號外顯子的胞內酪氨酸激酶結構域。配體與EGFR結合促進(jìn)胞內酪氨酸殘基自身磷酸化，激活自身酪氨酸激酶而活化。EGFR活化驅動(dòng)了一系列信號途徑活化。主要有兩條通路參與調節細胞增殖和存活：PI3K/AKT/mTOR信號途徑和RAS/RAF/MEK/MAPK信號途徑。這兩個(gè)信號途徑參與調節細胞周期，引起細胞增殖，凋亡，遷移，存活以及血管生成等。

    二、 EGFR原癌基因突變、DNA拷貝數、蛋白表達以及EGFR下游信號分子的改變和NSCLC患者EGFR靶向治療的關(guān)系2.1 EGFR突變

    EGFR突變可使TK受體組成性活化，并與EGFR-TKIs敏感性相關(guān)。伴有這些突變的患者接受Erlotinib或Gefitinib治療后反應率常大于70%.受體的不同突變位點(diǎn)具有不同的特點(diǎn)，而大多數突變會(huì )影響ATP結合位點(diǎn)，這也是TKI針對的靶點(diǎn) （圖2）。

    體外實(shí)驗表明EGFR突變增強TK活性，從而提高了腫瘤細胞對EGFR抑制劑的敏感性。研究發(fā)現TKI治療有效者常有EGFR基因第19號及21號外顯子突變，這些基因突變可用于篩選EGRF靶向治療對象。最常見(jiàn)的突變是第19 號外顯子上第745密碼子開(kāi)始缺失4個(gè)高度保守性氨基酸（LREA）。EGFR 突變者TKI治療有效率及無(wú)病生存期明顯好于無(wú)突變者。

    目前檢查突變最常用方法包括直接測序法及實(shí)時(shí)定量PCR,其它還有聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態(tài)（PCR-SSCP）分析和高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（HRMA），蝎形探針擴增阻滯突變系統及多靶實(shí)時(shí)定量PCR檢測試劑盒用于檢測腫瘤中常見(jiàn)的EGFR體細胞突變。這些敏感性和特異性高的試劑盒即使在混有野生型基因組DNA情況下，也能有效地檢測出EGFR突變。DxS Scorpions?技術(shù)可檢測第19號外顯子缺失突變（T790M, L858R, L861Q, G719Xs, S768I）以及外顯子中的3個(gè)插入突變 （2307_2308ins9, 2319_2320insCAC和2310_2311insGGT）。與直接測序相比，其它兩種方法在快速檢測EGFR突變上具有更高的特異性及敏感性。但臨床仍需應用直接測序驗證基因突變。目前國際上無(wú)EGFR基因突變檢測的指南，在檢測步驟中還需說(shuō)明EGFR突變位點(diǎn)的檢測數目。Jackman等發(fā)現223例未接受化療的晚期NSCLC患者中，EGFR 突變者TKI治療反應率為67%,疾病惡化時(shí)間為11.8個(gè)月，總體生存時(shí)間為23.9個(gè)月。與第21號外顯子L858R點(diǎn)突變相比，第19號外顯子缺失具有更長(cháng)的中位疾病惡化時(shí)間及總體生存時(shí)間。無(wú)論KRAS突變狀態(tài)，野生型EGFR突變預后常較差 （治療反應率，3%;疾病惡化時(shí)間，3.2個(gè)月）。對于篩選EGFR-TKI一線(xiàn)治療對象的指標而言，EGFR 基因型優(yōu)于臨床參數。

    圖2:EGFR活化突變以及EGFR靶向治療的機制  EGFR突變使EGFR酪氨酸激酶組成性活化。活化的EGFR磷酸化激酶域的酪氨酸殘基，從而激活下游效應子。EGFR靶向治療兩種方式：人源化的抗體（Y）以及酪氨酸激酶小分子抑制劑或TKIs （X）。抗體通過(guò)阻止配體與EGFR結合，抑制EGFR配體依賴(lài)的活化。TKIs通過(guò)阻止ATP與酪氨酸激酶胞內端結合，抑制EGFR自身磷酸化。抑制酪氨酸激酶活性，干擾了下游信號途徑的活化。

    研究表明大于75%EGFR-TKI治療有效者具有EGFR突變活性。但是，一些伴有EGFR常見(jiàn)突變的二次突變常常對EGFR-TKI靶向治療有耐藥性。EGFR基因第20外顯子突變常對Gefitinib治療無(wú)反應。而且，第20外顯子二次突變T790M占獲得性耐藥的50%.外周血循環(huán)腫瘤細胞的耐藥性突變位點(diǎn)的檢測可早期確定是否具有獲得性耐藥。

    一些臨床前期試驗表明EGFR-TKIs療效獲益不僅僅局限EGFR基因突變者。可能突變基因以外的分子機制也發(fā)揮著(zhù)一定作用。EGFR基因擴增以及受體/配體過(guò)表達等與EGFR抑制劑單藥敏感性相關(guān) .但IPASS臨床試驗顯示EGFR基因拷貝數增加而無(wú)EGFR基因突變患者對EGFR-TKI治療不能獲益。

    2.2 EGFR 拷貝數的改變

    NSCLC中EGFR基因擴增較常見(jiàn)，并常伴EGFR蛋白過(guò)表達。基因擴增和7號染色體多倍體均可導致EGFR基因拷貝數增加。由于個(gè)體差異及實(shí)驗技術(shù)的差別，EGFR擴增發(fā)生率12%-59%.部分研究表明EGFR基因的擴增常與TKI治療后生存率高相關(guān)。EGFR 基因拷貝數增加常與TKI治療預后好相關(guān)。因此，基因拷貝數的增加可以作為預測TKI治療反應性的一項指標。

    EGFR體細胞突變與治療反應率正相關(guān)具有肯定的結論。但EGFR基因拷貝數與EGFR-TKIs治療反應性的關(guān)系尚未取得一致性的結果。總之，對于預測TKIs治療反應性，EGFR 突變比EGFR基因獲得狀態(tài)更特異、更敏感[9].采用FISH檢測EGFR拷貝數發(fā)現30%的NSCLC有EGFR高拷貝數，雖然這些患者的EGFR突變狀態(tài)不清楚，但EGFR高拷貝數與TKI治療反應性好相關(guān)。約70%EGFR高拷貝數患者同時(shí)伴有EGFR體細胞突變，這一點(diǎn)混淆了EGFR高拷貝數的真正意義。 IPASS臨床試驗顯示EGFR突變是延長(cháng)無(wú)進(jìn)展生存期最有效的預測因子。有些學(xué)者認為EGFR基因拷貝數可用作預測NSCLC患者EGFR TKI療效反應及生存獲益的指標[16].但是IPASS臨床試驗證實(shí)EGFR基因高拷貝數而無(wú)EGFR基因突變患者對EGFR-TKI治療不能獲益。Hirsch等認為盡管EGFR突變及基因高拷貝數均能預測NSCLC患者Erlotinib療效，而EGFR拷貝數是預測不同患者Erlotinib治療生存獲益更有利的指標。

    檢測EGFR基因拷貝數方法包括FISH,顯色原位雜交（CISH），實(shí)時(shí)定量PCR （qPCR）。采用PCR檢測EGFR 基因拷貝顯示EGFR拷貝數增加與生存期延長(cháng)顯著(zhù)相關(guān)，提示其潛在的預后價(jià)值[9,21].EGFR 基因獲得可使疾病控制率從26%提高至67%,疾病進(jìn)展期從2.5個(gè)月延長(cháng)至9.0個(gè)月，生存時(shí)間從7個(gè)月延長(cháng)至18.7個(gè)月。值得注意的是EGFR基因拷貝數作為預測TKI療效的原因主要是其與EGFR突變相關(guān)。EGFR 突變是最好的療效預測因子。Hirsch等進(jìn)行的229例未經(jīng)化療的晚期NSCLC患者II期臨床試驗發(fā)現，如果FISH以多于40%的腫瘤細胞出現4個(gè)或更多拷貝數界定為拷貝數增加，76例患者中59.2%有EGFR基因拷貝數增加。EGFR有擴增患者（45%）對治療的反應好于無(wú)擴增者（26%）。有EGFR 擴增患者的中位無(wú)疾病進(jìn)展期為6個(gè)月，而無(wú)EGFR擴增的為3個(gè)月。EGFR有擴增組的中位整體生存時(shí)間為15個(gè)月，而無(wú)EGFR的擴增組僅為7個(gè)月。

    盡管大部分研究顯示NSCLC患者EGFR基因高拷貝數與EGFR-TKIs治療反應好及生存期長(cháng)相關(guān)，但對其是否具有預后價(jià)值仍存在爭論。有些研究認為作為篩選靶向治療病人的預測指標，EGFR基因拷貝數的敏感性和特異性均劣于EGFR突變。Douillard等也證實(shí)作為治療反應性及無(wú)疾病進(jìn)展期的預測因子，EGFR突變優(yōu)于EGFR拷貝數。

    2.3 EGFR 蛋白過(guò)表達

    盡管EGFR過(guò)表達的研究非常多，但結果卻不盡如人意。40%-80%NSCLC患者有EGFR蛋白過(guò)表達，并且與預后差相關(guān)。最初設想EGFR抗體對治療EGFR過(guò)表達患者可能有效。但早期臨床試驗提示EGFR過(guò)表達與抗EGFR抗體療效無(wú)明確相關(guān)性。此外，應用免疫組織檢測EGFR表達不能作為預測Cetuximab靶向治療療效的可靠手段。

    部分研究顯示免疫組化檢測EGFR過(guò)表達與TKI治療反應性好相關(guān)，但其它研究無(wú)類(lèi)似結果。多因素分析顯示EGFR表達水平與NSCLC治療客觀(guān)反應性及不良預后相關(guān)[18].幾項預后研究發(fā)現EGFR表達與生存獲益不相關(guān)。因此，EGFR過(guò)表達不能作為NSCLC生存預測因子。不同研究結果之間的差異可能是由于免疫組化EGFR陽(yáng)性判定的臨界值及實(shí)驗步驟無(wú)標準化指南有關(guān)。

    2.4 EGFR磷酸化

    EGFR異常活化在腫瘤發(fā)展及演進(jìn)中發(fā)揮著(zhù)重要作用。此外，最新研究表明EGFR突變及EGFR磷酸化活化狀態(tài)可影響NSCLC患者臨床經(jīng)過(guò)。兩種主要EGFR信號途徑：（PI3K）/Akt/mTOR和Ras/Raf/MAPK均參與EGFR引起腫瘤細胞增殖與存活。這些信號途徑的活化依賴(lài)關(guān)鍵信號分子磷酸化的活化。NSCLC最主要的致瘤分子機制是活化性突變。調節EGFR表達的機制如表觀(guān)遺傳學(xué)及異常轉錄因子的研究尚未得出肯定結論。MicroRNA是EGFR調節因子。Weiss等檢測3株NSCLC細胞株及NSCLC患者發(fā)現2株細胞株及55%的NSCLC患者有microRNA-128b的缺失。并且他們認為microRNA-128b可直接調節EGFR表達，microRNA-128b缺失與Gefitinib療效好及生存期長(cháng)相關(guān)。

    EGFR激酶域第845位酪氨酸磷酸化可以穩定EGFR活化環(huán)，維持受體活化狀態(tài)，提供與底物蛋白結合的位點(diǎn)。EGFR上另外兩個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)1068和1173可直接與GRB2直接結合，而且第1068位酪氨酸參與MAPK信號途徑的活化。

    EGFR活化可以通過(guò)抗EGFR磷酸化抗體檢測EGFR磷酸化狀態(tài)。EGFR基因C端磷酸化在募集信號分子及活化下游信號途徑中發(fā)揮著(zhù)重要作用。Endoh等短時(shí)間隨訪(fǎng)97例 NSCLC患者發(fā)現，EGFR磷酸化抗體陽(yáng)性患者生存期更長(cháng)。Hijiya等應用免疫組化方法檢測抗 992及1173酪氨酸磷酸化抗體在21例NSCLC腫瘤組織表達情況，他們發(fā)現第992位酪氨酸磷酸化與EGFR基因突變相關(guān)密切，提示EGFR磷酸化抗體可替代EGFR突變檢測，作為預測酪氨酸激酶抑制劑的療效的指標。所以NSCLC患者應用免疫組化方法檢測EGFR磷酸化狀態(tài)可潛在預測EGFR靶向藥物的療效，但仍需進(jìn)一步臨床驗證。

    2.5 EGFRvIII

    EGFRvIII,一種最新發(fā)現的EGFR缺失突變體，是基因重排或mRNA剪切錯誤所致的第2至第7外顯子編碼序列框內缺失突變體。這種突變體比野生型EGFR少了267個(gè)氨基酸，在融合位點(diǎn)上形成了一個(gè)新的多肽。研究表明EGFRvIII突變體和野生型EGFR功能不同。盡管EGFRvIII不能與EGF等配體結合，但其自身酪氨酸激酶可組成性活化，受體自身磷酸化。 NSCLC常有EGFRvIII表達，且表現為活化的磷酸化狀態(tài)。因此，持續活化的EGFRvIII可能在肺癌發(fā)病中發(fā)揮重要作用，同時(shí)也可作為抗肺癌藥物的潛在靶點(diǎn)。 針對EGFRvIII的特異性抗體也可用于肺癌的靶向治療。EGFRvIII特異性單克隆抗體可以抑制EGFRvIII高表達小鼠腫瘤細胞的生長(cháng)，提高小鼠生存時(shí)間。EGFRvIII特異性抗體只與EGFRvIII突變體結合，不能與野生型EGFR結合，因此應用EGFRvIII抗體能更好的檢出EGFRvIII突變體。

    EGFRvIII突變體在NSCLC發(fā)病中的作用仍不太清楚。文獻中報道EGFRvIII突變體在NSCLC患者檢測率為0到42%.這些差異可能是由于檢測腫瘤的組織學(xué)類(lèi)型不同或者技術(shù)誤差造成。免疫組化檢測發(fā)現EGFRvIII突變體還存在于其它許多腫瘤。但是由于EGFR基因長(cháng)、基因組結構復雜（含28個(gè)外顯子，全長(cháng) 約為190 kb）、第1內顯子長(cháng)（123kb）并且常發(fā)生基因缺失，因此在基因水平檢測EGFRvIII突變非常困難。Okamoto等應用免疫組化檢測EGFRvIII突變單克隆抗體在76例NSCLC的表達情況，發(fā)現EGFRvIII在39% （30/76）的NSCLC中表達；而基因分析檢測EGFRvIII突變體僅為3%.他們還發(fā)現EGFRvIII也可以在正常肺組織中表達，因此對免疫組化檢測 EGFRvIII突變產(chǎn)生了質(zhì)疑。

    研究證實(shí)了小分子TKIs對有EGFR激酶突變NSCLC患者的臨床靶向治療有療效。但是，這些小分子抑制劑是否能針對EGFRvIII突變尚不清楚。Ji 等[32] 報道EGFRvIII突變在人肺鱗癌中的表達率為5% （3/56），但肺腺癌（0/123）中卻無(wú)EGFRvIII突變。他們同時(shí)發(fā)現EGFRvIII突變的腫瘤對某些TKI有耐藥性，而對另一些TKI卻有反應性。體內實(shí)驗證明，加入不可逆的EGFR抑制劑HKI-272一周后能明顯縮小EGFRvIII致瘤小鼠的腫瘤體積。Erlotinib處理3只小鼠7天，腫瘤體積平均減少45%.而HKI-272處理后，腫瘤體積平均減少88%.轉染EGFRvIII 突變體的Ba/F3細胞對Gefitinib和Erlotinib耐藥，而對HKI-272較敏感。因此，應用TKI對有EGFRvIII突變的肺癌患者具有潛在療效。

    三、EGFR 檢測和靶向治療

    由于EGFR 過(guò)表達作為預后因子的研究缺乏重復性，研究者致力于EGFR突變型特異性結合的抗體的研制。Cell Signaling公司（Danvers, MA）研制出兩種針對EGFR最常見(jiàn)突變位點(diǎn)的特異性抗體：第19號外顯子 15-bp/5-氨基酸缺失突變（E746-A750del）和第21號外顯子 L858R點(diǎn)突變。 Yu 等用這兩種抗體采用免疫組化的方法檢測40例NSCLC標本中EGFR突變的基因型，并且每例均用DNA測序驗證。這兩種抗體也可用于Western blotting、免疫熒光以及免疫組化染色。在340個(gè)石蠟包埋的NSCLC標本中應用這兩種抗體，與DNA直接測序及質(zhì)譜DNA測序相比，其敏感性和特異性分別為92%和99%.這表明應用突變特異性抗體是篩選預測肺癌患者EGFR靶向治療療效的一個(gè)快速、敏感、特異及經(jīng)濟有效的方法。Brevet 等應用這兩種EGFR突變特異性單克隆抗體在218例肺腺癌石蠟組織中進(jìn)行免疫組化檢測，發(fā)現采用1+為陽(yáng)性臨界值，EGFR L858R點(diǎn)突變抗體的敏感性為95%,陽(yáng)性預測值為95%;若采用2+為陽(yáng)性臨界值，抗體的敏感性為76%,而陽(yáng)性預測值為100%.因此，免疫組化檢測EGFR突變特異性抗體可以用于篩選EGFR靶向治療對象。

    筆者提出的非小細胞肺癌患者分子檢測流程（圖3）。 按肺癌突變的頻率逐步進(jìn)行分子檢測，并對肺癌患者進(jìn)行評估，從而給予相應的靶向治療。
 

    圖3:小細胞肺癌分子檢測的流程  根據不同分子突變的頻率建議病人逐級檢測。非小細胞肺癌占所有肺癌85%,可檢測EGFR突變。EGFR突變陽(yáng)性，白種人占20%,東亞人占40%,EGFR TKI靶向治療有效率為80%. 無(wú)EGFR突變，白種人占 80%,東亞人占60%.這些病人進(jìn)一步檢測EML4-ALK突變，EML4-ALK 突變僅占NSCLC人群的3%,這類(lèi)突變患者對靶向治療有效率為53%.無(wú)EML4-ALK突變還可進(jìn)行其他分子檢測3.2 EGFR 靶向治療

    兩種方法可以抑制EGFR信號途徑：一種是通過(guò)EGFR單克隆抗體阻止配體與胞外域結合，另一種是應用小分子抑制胞內酪氨酸激酶活性。后者首先應用于臨床。EGFR-TKIs是通過(guò)可逆的競爭性抑制ATP與EGFR-TK域的結合而發(fā)揮作用。體細胞EGFR活化突變，基因拷貝數增加，某些臨床病理特征等與NSCLC患者靶向治療療效好和預后佳密切相關(guān)。但這些患者的大部分都具有EGFR-TKIs 獲得性耐藥。EGFR基因二次突變位點(diǎn)T790M、表達HGF、PTEN和/或EGR-1以及上皮間質(zhì)轉化（EMT）均與EGFR-TKI耐藥相關(guān)。Uramoto等發(fā)現8個(gè)T790M突變病例中6個(gè)高表達HGF,3個(gè)（38%）病例有PTEN缺失。7個(gè)病例中2個(gè)（29%） 有EGR-1缺失，其中一個(gè)有PTEN缺失。7個(gè)病例中4個(gè)（57%） 表達磷酸化Akt （p-Akt）。9個(gè)病例中4例（44%）在治療過(guò)程中出現上皮間質(zhì)轉化（EMT）。因此EGFR-TKIs 耐藥機制涉及基因、蛋白等多因素的改變。

    部分EGFR體細胞活化突變的NSCLC對酪氨酸激酶抑制劑具有反應。如上所述，獲得性耐藥與EGFR二次突變位點(diǎn)T790M相關(guān)。Bell等[20]報道一個(gè)家族中多個(gè)NSCLC的發(fā)生均與EGFR T790M突變相關(guān)。EGFR信號通路的改變是家族性NSCLC遺傳易感的罪魁禍首，使家族肺癌患者增加。

    3.2.1單克隆抗體

    Cetuximab和Panitumumab是人/鼠嵌合或完全人源性抗EGFR胞外域單克隆抗體，它們通過(guò)抑制活化的配體與EGFR的結合而發(fā)揮作用。這種靶向治療通過(guò)抑制配體依賴(lài)的EGFR的活化，從而抑制下游信號途徑活化，達到縮短細胞周期進(jìn)程、抑制細胞生長(cháng)以及血管生成（圖2A）。此外，EGFR單克隆抗體還能促進(jìn)EGFR內化、降解，終止EGFR信號途徑[26]. 完全人源性抗體Panitumumab與EGFR親和力高，其半衰期更長(cháng)。盡管NSCLC患者常表達EGFR,但抗EGFR抗體僅對部分患者有效。

    3.2.2 酪氨酸激酶抑制劑

    TKIs是人工合成的小分子，通過(guò)與ATP競爭性結合EGFR TK域。Gefitinib和Erlotinib是針對EGFR特異的酪氨酸激酶抑制劑，但同時(shí)也可抑制其他受體，如HER2和VEGFR2.TKIs通過(guò)結合酪氨酸激酶，阻斷EGFR分子內自身磷酸化及酪氨酸激酶活化，阻止胞內下游信號途徑的活化（圖 2B）。

    四、EGFR靶向治療耐藥性機制

    4.1 二次突變引起的獲得性耐藥

    盡管EGFR突變與Gefitinib和Erlotinib高敏感性相關(guān)，但仍有部分EGFR突變患者對EGFR-TKI治療并不敏感。EGFR-TKIs耐藥性可分為原發(fā)性耐藥和治療后引起繼發(fā)性耐藥。大部分病人對 Gefitinib和Erlotinib初始治療敏感，但最終可發(fā)展為耐藥及疾病進(jìn)展。

    TKI藥物敏感性相關(guān)的突變主要有四種：第18外顯子點(diǎn)突變 （G719A/C）、第21外顯子點(diǎn)突變 （L858R和L861Q）以及第19 號外顯子從第745位賴(lài)氨酸殘基缺失4個(gè)高度保守性氨基酸（LREA）的框內缺失突變。此外第20外顯子D770-N771插入突變也與EGFR-TKI耐藥性相關(guān)。體外實(shí)驗證實(shí)第20外顯子插入突變對EGFR-TKIs反應性比第19和第21外顯子點(diǎn)突變弱。

    獲得性耐藥機制包括兩個(gè)方面：其一是在治療過(guò)程中EGFR基因出現了二次突變革變了EGFR蛋白質(zhì)編碼序列，其二是出現了其它原癌基因的擴增。

    Kobayashi等報道一名接受Gefitinib治療達完全緩解，兩年后復發(fā)的NSCLC患者，其復發(fā)的腫瘤細胞除了有服藥前的EGFR突變位點(diǎn)外，第20外顯子上又出現了二次突變位點(diǎn)T790M.基因構象及生物化學(xué)的分析表明二次突變可導致Gefitinib耐藥。Pao等幾乎同時(shí)發(fā)現相同的突變位點(diǎn)T790M導致Gefitinib 或Erlotinib獲得性耐藥。Gefitinib耐藥病例EGFR激酶域均有T790M二次突變。第790位密碼子被稱(chēng)為“管家密碼子”, 它決定了抑制劑與EGFR上ATP結合位點(diǎn)的特異性。EGFR第790位突變?yōu)榧琢虬彼幔笶GFR空間結構改變，阻止與TKIs Gefitinib或Erlotinib的結合，產(chǎn)生耐藥。 這個(gè)突變位點(diǎn)有利于腫瘤細胞存活，也可作為篩選TKI靶向治療耐藥基因的指標。這些耐藥基因的發(fā)現推動(dòng)了不可逆的EGFR-TKI靶向藥物的發(fā)展，尋找更好的針對耐藥的靶向藥物。

    EGFR下游癌基因KRAS、BRAF、PIK3CA和PTEN的活化在治療反應中作用也成為研究熱點(diǎn)。EGFR下游主要信號途徑RAS/MAPK和PI3K/AKT均參與調節細胞增殖及存活。EGFR下游信號途徑的突變也可導致EGFR-TKI耐藥。 研究發(fā)現MET激酶的擴增以及EML4-ALK 融合基因的突變，可激活RAS/RAF/MEK通路，使EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥。

    4.2 KRAS 突變

    KRAS 在EGFR信號通路中發(fā)揮著(zhù)重要作用，原癌基因KRAS編碼的G蛋白是EGFR等生長(cháng)因子活化下游Ras/MAPK信號通路的重要蛋白。

    結直腸癌診治最重要的發(fā)現之一是KRAS的突變狀態(tài)與抗EGFR單克隆抗體（Panitumumab和Cetuximab）的靶向治療療效相關(guān)。部分腫瘤有KRAS基因第2號外顯子體細胞突變，RAS-GTP水解為GDP,激活RAS信號途徑。在KRAS突變的腫瘤中，KRAS蛋白持續活化，可以不依賴(lài)上游EGFR信號，從而對EGFR靶向藥物Cetuximab或Panitumumab不敏感。

    KRAS突變在肺癌患者中占15%-30%,在TKI治療無(wú)效者中約占35%-45%.大約30%的肺腺癌具有KRAS活化突變，與EGFR-TKI耐藥相關(guān)[40].值得一提的是，KRAS突變在肺癌中比較常見(jiàn)，但是KRAS和EGFR突變同時(shí)存在卻很少見(jiàn)。KRAS和EGFR突變很少同時(shí)出現在同一類(lèi)型的腫瘤中，提示這些信號分子對NSCLC的發(fā)生和發(fā)展起著(zhù)重疊作用。但是，越來(lái)越多證據顯示少數情況下EGFR和KRAS突變可以同時(shí)存在。 由于這種情況罕見(jiàn)，很難得出肯定結論，但是目前研究認為EGFR/KRAS突變與EGFR-TKI療效負相關(guān)。

    關(guān)于KRAS突變是否可以用于評估EGFR靶向治療仍不清楚。盡管KRAS突變與EGFR-TKI治療無(wú)反應相關(guān)，但與無(wú)疾病進(jìn)展時(shí)間以及總體生存時(shí)間關(guān)系尚不清楚。小樣本臨床試驗證實(shí)KRAS突變是接受EGFR-TKIs治療的負相關(guān)預測因子，由于KRAS突變發(fā)生率低，目前缺乏大規模臨床試驗進(jìn)一步驗證。一些研究表明NSCLC中KRAS突變可作為抗EGFR單克隆抗體療效的負相關(guān)預測因子，也在TKI耐藥中發(fā)揮作用。與結直腸癌不同，在肺癌中KRAS突變不能作為篩選抗EGFR單克隆抗體治療不能獲益患者的指標。

    KRAS突變出現在第2號外顯子第12和13密碼子，激活EGFR非依賴(lài)的胞內信號轉導。Eberhard等[45]應用測序檢測274位腫瘤患者EGFR第18-21號外顯子和KRAS第2外顯子突變情況，發(fā)現KRAS突變占21%,與Erlotinib聯(lián)合化療治療后患者疾病進(jìn)展時(shí)間及生存時(shí)間縮短相關(guān)。但有些報道認為KRAS突變不影響EGFR-TKI治療效果。一項關(guān)于Erlotinib或Gefitinib單藥治療223例未接受化療的進(jìn)展期肺癌患者的研究發(fā)現，EGFR突變與67%治療反應率相關(guān)。無(wú)論KRAS突變狀態(tài)如何，野生型EGFR患者均與不良預后相關(guān)。

    Wang等應用PCR-限制性片段長(cháng)度多態(tài)性檢測273位NSCLC患者KRAS基因12,13密碼子突變[47],120位患者接受了EGFR-TKI靶向治療，KRAS突變患者中僅5.3% （1/19）對治療有反應，而無(wú) KRAS突變患者治療反應率為29.7%.KRAS突變患者中位無(wú)疾病進(jìn)展期為2.5個(gè)月，而野生型KRAS患者中位無(wú)疾病進(jìn)展期為8.8個(gè)月。

    Linardou等應用Meta分析得出 KRAS體細胞突變是晚期肺癌患者接受EGFR-TKI單藥治療療效負相關(guān)預測因子。17篇文獻中1008例NSCLC患者中165例 （16%）有KRAS突變。KRAS突變與TKI治療缺乏反應密切相關(guān)。

    EGFR抑制劑獲益的患者需具備完整的KRAS基因，但這一點(diǎn)并不足夠，其他因素也可能產(chǎn)生對EGFR抑制劑耐藥性。NSCLC患者KRAS突變占20%,其中少于3%患者同時(shí)具有EGFR突變，其余97% 為野生型EGFR.KRAS/EGFR同時(shí)突變和EGFR野生型與EGFR靶向治療無(wú)反應性相關(guān)。

    4.3 BRAF突變

    KRAS和BRAF基因位于EGFR信號通路下游，是該信號通路的基本組成成分。BRAF蛋白是依賴(lài)KRAS-GTP活化的絲/蘇氨酸激酶。BRAF主要功能包括通過(guò)磷酸化活化MAPK、MEK1和MEK2信號途徑。突變的BRAF蛋白激酶活性增加，使NIH3T3細胞發(fā)生轉化。不論KRAS是否有突變，BRAF突變都可促進(jìn)腫瘤細胞生長(cháng)。

    BRAF與KRAS突變呈現相互排斥的現象。BRAF突變與腺癌的不同的組織學(xué)亞型具有相關(guān)性。Yousem 等分析了222例無(wú)KRAS和EGFR突變的肺腺癌患者。其中10例腺癌有BRAF-V600E突變。 BRAF突變常見(jiàn)于微**亞型。 De等檢測了15例原發(fā)微**型肺腺癌，發(fā)現3例（20%）有BRAF突變。BRAF-V600E突變在女性肺癌患者稍多（6:4）。老年人發(fā)生小葉內衛星結節及N2期淋巴結轉移較多[48].腺癌大部分是伴有**狀亞型（80%）和細支氣管肺泡亞型（50%）混合亞型腺癌。由于小樣本量實(shí)驗結果，目前仍不能肯定BRAF突變是否為肺癌***的分子亞型。

    結直腸癌患者中BRAF突變能降低Panitumumab或Cetuximab療效。通過(guò)對132例患者的回顧性研究分析，治療有效者均無(wú)BRAF突變，而79例無(wú)效患者中11位（14.0%）有BRAF V600E等位基因突變。

    然而與KRAS相比，BRAF突變在NSCLC患者中檢出率較低。據報道8%的BRAF突變位于BRAF激酶域。Brose等在292例NSCLC肺癌患者中發(fā)現5例（1.7%）有BRAF突變。其中，3例突變位于第11號外顯子，2例突變位于第15號外顯子。BRAF是EGFR下游信號分子，其是否能作為EGFR抑制劑療效的預測分子仍需大量臨床試驗驗證。 V600E錯義突變是BRAF蛋白質(zhì)第600位密碼子的纈氨酸被谷氨酸取代，90%惡性腫瘤中可以檢測出這種突變。惡性腫瘤常出現絲氨酸-蘇氨酸激酶BRAF點(diǎn)突變，它給部分 NSCLC患者靶向治療帶來(lái)新的契機。

    4.4 ALK 基因重排

    間變淋巴瘤激酶（ALK）基因編碼受體酪氨酸激酶，ALK融合蛋白是由ALK胞內激酶域和其它基因的氨基酸端組合而成。部分NSCLC患者基因組有EML4-ALK融合基因。目前肺癌**發(fā)現7個(gè)融合基因。所有融合基因的ALK胞內端酪氨酸激酶域均起始于第20號外顯子編碼的基因序列。EML4-ALK由第2號染色體短臂插入（p21;p23）引起，編碼活化的蛋白酪氨酸激酶。 有研究發(fā)現EML4-ALK基因融合是由EML4不同的外顯子與ALK結合而成。 ALK也可與其它基因結合形成融合基因，如KIF5B和TFG.活化的ALK通過(guò)激活下游PI3K/Akt和MAPK信號途徑參與抑制細胞凋亡，促進(jìn)細胞增殖。NSCLC人群中EML4-ALK融合基因陽(yáng)性率很低，大約6%[50].EML4-ALK基因融合以及EML4-ALK融合蛋白可活化 RAS/RAF/MEK/MAPK信號途徑。此外，其它兩種少見(jiàn)的ALK融合基因也有報道。攜帶EML4-ALK 融合基因的NSCLC患者均為野生型EGFR和KRAS.他們多為年輕人，發(fā)現時(shí)常為晚期，無(wú)吸煙史，腫瘤常呈實(shí)體型，且常出現印戒細胞。

    一項關(guān)于攜帶EML4-ALK融合基因肺癌患者服用MET/ALK小分子抑制劑，PF-02341066的I/II期臨床試驗。19例攜帶EML4-ALK融合基因非小細胞肺癌患者，其中10例（53%）對PF-02341066客觀(guān)療效。其中15例（79%）在接受治療8周后發(fā)現腫瘤受到抑制，部分患者維持到40周，僅有4例出現疾病進(jìn)展。Kwak等 發(fā)現1,500例晚期NSCLC患者中82例攜帶ALK融合基因。其中大部分 （96%）為腺癌。94%患者既往接受過(guò)至少一項治療。82位患者均接受口服crizotinib（ALK TKI小分子抑制劑）治療，疾病控制率為90%,其中治療反應率為57%,其余33%病情穩定。Rodig等探討了關(guān)于西方人肺腺癌中ALK重排發(fā)生率以及重排特點(diǎn)，旨在優(yōu)化臨床檢測ALK重排的模式。他們應用FISH和免疫組化檢測358例肺腺癌標本，再次證明ALK重排與年輕患者，無(wú)吸煙史，臨床呈進(jìn)展期，組織學(xué)呈伴有印戒細胞的實(shí)體型腺癌相關(guān)。ALK重排不會(huì )同時(shí)伴有EGFR突變。這項研究證明西方人ALK重排少見(jiàn)，但卻代表了一個(gè)***的臨床亞型，并且有可能對這類(lèi)患者選擇不同治療方法。對于可疑病例，FISH和免疫組化同時(shí)驗證對診斷肺腺癌ALK重排更準確[52].Zhang等通過(guò)對266例中國NSCLC患者的研究，得出相似的結論。

    Shaw等在141例NSCLC患者中發(fā)現19例（13%）有EML4-ALK融合基因，31例 （22%）有EGFR突變，91例（65%）兩者均為野生型[42].其它研究也表明EML4-ALK 和EGFR存在具有排斥性[42].但是，Tiseo等報道一例48歲無(wú)吸煙史的白種人診斷為EGFR突變和ALK轉位同時(shí)存在的肺癌患者，并且對Erlotinib耐藥，這可能代表一小部分NSCLC患者。EML4-ALK重排人群中無(wú)EGFR突變，而EGFR突變人群無(wú)ALK重排[42]. 轉移肺癌患者，EML4-ALK重排與EGFR-TKI耐藥相關(guān)。

    與EGFR突變人群和野生型EGFR/ALK人群相比，EML4-ALK融合基因肺癌人群更年輕，男性居多[42].但是，也有研究顯示男女相當。EML4-ALK融合基因肺癌人群更多是無(wú)或少吸煙史。19例EML4-ALK陽(yáng)性肺癌中18例為腺癌，大部分為印戒細胞亞型。EML4-ALK代表NSCLC一種特殊的分子亞型。特別指出的是EML4-ALK融合基因肺癌患者不能獲益于EGFR-TKI靶向治療，需應用ALK靶向藥物。

    總之，以EGFR為靶點(diǎn)的治療能有效治療NSCLC患者。EGFR突變可作為篩選EGFR-TKI靶向治療對象的指標，同時(shí)也可作為EGFR靶向療效的預測因子。但是，越來(lái)越多證據顯示NSCLC具有多種亞型，每種亞型都具有各自獨特的分子改變。確定分子亞型、篩選靶向治療人群的指標都是NSCLC個(gè)體化治療的關(guān)鍵。EGFR及下游因子檢測有助于篩選合理的治療對象，KRAS/BRAF 突變與EGFR突變存在相互排斥，很少同時(shí)出現在NSCLC患者。這也可能在肺癌病因學(xué)及EGFR-TKI靶向治療耐藥中發(fā)揮重要作用。總之，EGFR或其下游關(guān)鍵分子靶向治療將成為未來(lái)NSCLC治療的規范化治療手段。聯(lián)合預測模式不能應用于所有腫瘤類(lèi)型，仍需更好地篩選合理治療對象，EGFR分子指標仍需進(jìn)一步研究并結合臨床參數，更好指導NSCLC患者的治療策略，實(shí)現真正的個(gè)體化診治。

    參考文獻

    1.Cheng L, Alexander RE, MacLennan GT, et al. Molecular pathology of lung cancer: Key to personalized medicine. Mod Pathol 25:347-369, 2012.

    2.Cheng L, Eble JN （ed） Molecular Surgical Pathology, 1st edition, Springer, New York, NY, 2013.

    3.Cheng L, Zhang DY, Eble JN （ed） Molecular Genetic Pathology, 2nd edition, Springer, New York, NY, 2013.

    作者簡(jiǎn)介：

    程亮，現任美國印第安那大學(xué)醫學(xué)院病理系及泌尿系終身教授，分子診斷實(shí)驗室主任，泌尿病理主任。程亮畢業(yè)于北京醫科大學(xué)（北京大學(xué)醫學(xué)部），后在美國Case Western Reserve University和Mayo Clinic接受專(zhuān)業(yè)病理訓練，持有美國外科病理、臨床病理和分子遺傳醫師***。現任Molecular Cancer （Associate Editor）， Eur J Cancer, Future Oncology, Urol Oncol, Crit Rev Hematol Oncol, Am J Surg Patholy, Mod Pathol, Hum Pathol,J Pathol, Histopathology, J Clin Pathol等30多個(gè)雜志的編委，在影響因子較高的期刊，包括PNAS,JNCI,J Clin Oncol, Cell Metabolism, Nature Biotechnol, Cancer Res, Oncogene和Clin Cancer Res,發(fā)表學(xué)術(shù)論文700多篇， 被引用超過(guò)23000多次（h-index,80）。主編和撰寫(xiě)著(zhù)作有Molecular Genetic Pathology, Urologic Surgical Pathology,Essentials of Anatomic Pathology,Atlas of Genitourinary Pathology,Molecular Surgical Pathology, Rare Urologic Tumors,Atlas of Anatomic Pathology,及Bladder Pathology.