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    傳統觀(guān)念認為膿毒癥（sepsis）是一種失控的、持久性全身炎癥反應。目前，人們漸漸認識到，在膿毒癥的發(fā)病過(guò)程中機體并非處于一成不變的免疫激活狀態(tài)，負向調控（negative regulation）機制在膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展中也發(fā)揮著(zhù)重要作用。機體在免疫應答正常或沒(méi)有外界急性損害的情況下，正向與負向調控處于平衡狀態(tài)并維持各項生命活動(dòng)的正常運行。但嚴重創(chuàng )傷、休克及膿毒癥時(shí)機體不僅出現過(guò)度的炎癥反應，而且存在著(zhù)嚴重細胞免疫功能低下，表現為淋巴細胞大量凋亡和免疫無(wú)反應性，這與免疫負向調控效應密切相關(guān)[1, 2]。機體免疫功能障礙的原因是多方面的，不論是抑制性免疫細胞、細胞因子還是信號轉導通路的變化均系負向調控發(fā)揮作用的重要途徑，深入了解負向調控在膿毒癥中的作用及意義，在關(guān)鍵環(huán)節進(jìn)行精確干預將有助于恢復機體正常的免疫應答狀態(tài)、防止嚴重感染并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展。

    1 中樞神經(jīng)系統調控外周免疫反應的負向神經(jīng)信號途徑

    中樞神經(jīng)系統調控外周免疫反應的神經(jīng)信號通路主要包括下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感神經(jīng)系統和副交感神經(jīng)系統等。當機體受到感染等外來(lái)打擊時(shí)，可迅速產(chǎn)生應激，調動(dòng)機體內部各系統發(fā)生變化，以維護內環(huán)境的穩態(tài)，確保生長(cháng)、再生與修復等基本生理功能正常。其中下丘腦-垂體-腎上腺軸及交感神經(jīng)系統是機體應激反應中重要的“指揮者”與“執行者”；與此同時(shí)，副交感神經(jīng)系統的植物神經(jīng)功能受到抑制。我們初步的研究發(fā)現，神經(jīng)內分泌激素對創(chuàng )（燒）傷后免疫功能及感染的反應性具有重要調節作用。嚴重創(chuàng )傷、燒傷和感染病理過(guò)程中，自主神經(jīng)系統以及下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活使應激激素濃度增加，造成免疫麻痹、高代謝和心血管功能異常等；如不及時(shí)糾正，會(huì )出現惡病質(zhì)和進(jìn)行性器官功能障礙，甚至死亡。由此可見(jiàn)，神經(jīng)-內分泌-免疫系統功能失調是膿毒癥常見(jiàn)的病理生理反應，弄清其確切發(fā)病機制無(wú)疑具有重要臨床意義。新近的臨床觀(guān)察表明，針對神經(jīng)-內分泌-免疫功能失調致病環(huán)節進(jìn)行有效干預，可能是防止嚴重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）的根本途徑之一[3]。

    既往許多研究主要關(guān)注下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經(jīng)系統對外周炎癥免疫的調控，但有資料提示β腎上腺素能阻斷劑并不能完全調節外周自主神經(jīng)系統平衡，故對神經(jīng)系統負向調控的研究日益受到重視，尤其是副交感神經(jīng)通路（主要通過(guò)迷走神經(jīng)）。迷走神經(jīng)是自主神經(jīng)系統的周?chē)糠种唬涔澢吧窠?jīng)元位于腦干及脊髓灰質(zhì)內，節后神經(jīng)元分散在效應器附近，節前后纖維均為膽堿能神經(jīng)纖維（包括傳入和傳出纖維），迷走神經(jīng)的主要遞質(zhì)是乙酰膽堿。據報道，神經(jīng)系統通過(guò)迷走神經(jīng)能夠顯著(zhù)、快速地抑制巨噬細胞腫瘤壞死因子（TNF）-α和高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）的釋放，減輕全身性炎癥反應。這一生理機制稱(chēng)作“膽堿能抗炎通路”，通過(guò)抑制促炎細胞因子的合成反饋地監控和調節炎癥過(guò)程，該效應主要依賴(lài)于細胞上煙堿型乙酰膽堿受體α7亞單位（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7 nAChR） [4]。研究證實(shí)，α7 nAChR廣泛表達于炎性細胞和免疫細胞，包括T淋巴細胞、樹(shù)突狀細胞（DC）等；我們新近發(fā)現，CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）表面也存在此受體，適當濃度煙堿刺激Treg可上調其主要表面分子T淋巴細胞毒性相關(guān)抗原（CTLA）-4和叉頭翼狀螺旋轉錄因子（Foxp3）表達，最終增強Treg介導的T淋巴細胞免疫抑制活性；而α7 nAChR特異性拮抗劑能逆轉煙堿的上述效應，表明α7 nAChR是介導Treg抑制效應的受體之一[5]。此外，膽堿能抗炎通路可通過(guò)阻止T淋巴細胞的分化和成熟、抑制中性粒細胞及單核細胞的殺傷功能發(fā)揮免疫調節效應。與已經(jīng)確認的體液調節途徑相比，膽堿能炎癥反射調節途徑具有快速、局部化和綜合性的特點(diǎn)。迷走神經(jīng)傳出信號為神經(jīng)調節免疫反應提供了直接通路，同時(shí)展示了新的概念：神經(jīng)-免疫軸通過(guò)神經(jīng)調節免疫應答，進(jìn)而控制炎癥反應，自主神經(jīng)系統在大腦與免疫系統之間的雙向通訊中發(fā)揮了中樞監控免疫狀態(tài)、控制炎癥反應的作用[6]。

    2 膿毒癥病理過(guò)程中外周細胞免疫反應的負向調控作用

    在機體的負向調控途徑中，不同免疫細胞亞群發(fā)揮著(zhù)重要調節作用，其中Treg日益受到高度關(guān)注。Treg作為一類(lèi)具有免疫調節功能的成熟T細胞亞群，不僅在免疫自穩、移植耐受、腫瘤免疫、過(guò)敏反應等方面具有重要意義，而且在感染免疫方面也可通過(guò)對細胞免疫抑制發(fā)揮核心調節作用[7, 8]。Treg的種類(lèi)較多，一般依據其發(fā)育、特異性及作用機制多分為天然Treg和獲得性Treg。天然Treg主要由胸腺發(fā)育成熟后進(jìn)入外周淋巴組織，目前了解較多的是CD4+CD25+ Treg；獲得性Treg是成熟T細胞（CD4+CD25- T細胞）在外周淋巴組織中接觸特異性抗原或在免疫抑制因子如白介素（IL）-10、轉化生長(cháng)因子（TGF）-β的作用下活化而誘導產(chǎn)生。業(yè)已明確，Treg的免疫調節表現為免疫抑制性與免疫無(wú)能性，其對效應性T細胞的抑制反應主要通過(guò)細胞接觸機制和細胞因子分泌方式起作用。Treg抑制機制的發(fā)揮涉及多個(gè)膜表面分子、細胞因子和其他可溶性因子的作用，其中TGF-β與IL-10作為主要抑制性細胞因子可介導其抑制功能的發(fā)揮，Foxp3則特異地表達于CD4+CD25+ Treg，其基因改變所致轉錄因子的功能異常直接影響Treg表型及活性的發(fā)揮。此外，IL-35是一種最近新發(fā)現的抑制性細胞因子，它可由CD4+CD25+ Treg特異性產(chǎn)生，是Treg發(fā)揮抑制作用所必須的細胞因子[9]。

    我們的資料證實(shí)，嚴重燙傷可使大鼠脾臟CD4+CD25+ Treg表面分子CTLA-4和Foxp3表達明顯增強，并促進(jìn)其免疫抑制功能成熟。與此同時(shí)，燙傷后脾組織CD4+CD25+ Treg分泌IL-10水平與假燙傷組比較也顯著(zhù)升高[10]。臨床試驗結果顯示，燒傷后并發(fā)膿毒癥患者Treg表面CTLA-4及Foxp3表達顯著(zhù)高于無(wú)膿毒癥患者，膿毒癥死亡組其表達亦顯著(zhù)高于存活組。由此可見(jiàn)，嚴重燒傷可促進(jìn)外周血CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟，并刺激其分泌大量抑制性細胞因子發(fā)揮負向調節作用，從而導致機體細胞免疫功能低下甚至免疫紊亂的發(fā)生[10, 11]。那么是什么因素促進(jìn)了嚴重損傷后CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟呢？我們初步實(shí)驗提示，HMGB1可作為一種免疫調節因子，在外周參與調控Treg和T淋巴細胞免疫功能狀態(tài)。實(shí)驗結果表明：燙傷后HMGB1的持續升高可刺激Treg向成熟發(fā)展，從而介導T淋巴細胞增殖反應低下，并向輔助性T細胞（Th） 2漂移，免疫功能受抑；HMGB1介導的Treg功能成熟還可通過(guò)下調T淋巴細胞核因子（NF）-κB活性而減少I(mǎi)L-2基因表達和蛋白合成，進(jìn)而影響T淋巴細胞的增殖反應活性[10]。在此基礎上，我們觀(guān)察了HMGB1攻擊后不同基因型小鼠CD4+CD25+ Treg免疫功能的改變及其受體作用機制。給C3H/HeN和C3H/HeJ [分別為T(mén)oll樣受體4野生型（TLR4+/+）和天然突變型（TLR4-/-）] 小鼠腹腔注射不同劑量HMGB1，發(fā)現C3H/HeN小鼠CD4+CD25+ Treg表達CTLA-4水平顯著(zhù)下降，同時(shí)生成IL-10量也明顯降低；但不同劑量HMGB1攻擊可引起C3H/HeJ小鼠CD4+CD25+ Treg表達CTLA-4明顯上調和生成IL-10量增加。提示TLR4在HMGB1誘導CD4+CD25+ Treg免疫活性過(guò)程中發(fā)揮了重要負向調控作用[12]。

    3 膿毒癥時(shí)參與免疫負向調節的新蛋白分子

    在急性損傷或膿毒癥過(guò)程中，一些免疫負調控分子發(fā)揮著(zhù)重要作用。TNF-α誘導蛋白-8樣分子2 （tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2, TIPE2） 是一個(gè)新發(fā)現的蛋白分子，主要選擇性表達于淋巴源性和髓源性細胞。TIPE2是維持宿主免疫穩態(tài)所必需的，主要通過(guò)對T細胞受體和Toll樣受體（TLRs）信號途徑實(shí)行負向調控，進(jìn)而調節機體天然/獲得性免疫應答過(guò)程[13, 14]。有資料證實(shí)，小鼠TIPE2基因主要表達于胸腺、脾臟、淋巴結以及小腸粘膜等免疫器官或組織中，而在肝臟、心臟、肌肉、睪丸以及正常鼠的神經(jīng)系統均無(wú)表達，但在實(shí)驗性自身免疫腦脊髓炎動(dòng)物模型呈高表達。而TIPE2基因敲除小鼠體內細胞免疫應答反應嚴重受損，TIPE2基因缺失的T細胞培養上清Th1型細胞因子干擾素（IFN）-γ、Th2型細胞因子IL-4均呈不同程度的增加。進(jìn)一步觀(guān)察證實(shí)，TIPE2與前凋亡caspase-8存在聯(lián)系，可能通過(guò)前凋亡酶調節NF-κB通路。TIPE2能下調激活蛋白-1和 NF-κB的活化，TIPE2基因缺陷細胞呈現對TLR和T細胞受體信號活化的高反應性。此外，與正常野生型相比，TIPE2基因敲除動(dòng)物出現明顯膿毒性休克反應，TIPE2基因表達下調引起持續性淋巴細胞活化，可導致Fas表達增強并促進(jìn)淋巴細胞凋亡[13]。

    我們采用共聚焦熒光法對CD4+CD25+ Treg細胞內TIPE2的分布進(jìn)行初步定位，并從基因和蛋白水平檢測到Treg 細胞內TIPE2表達。結果顯示，CD4+CD25+ Treg細胞胞漿中高表達TIPE2，蛋白印跡證實(shí)Treg細胞中存在清晰的TIPE2條帶，同時(shí)檢測到147 bp大小的特異性TIPE2目的基因條帶。證明TIPE2在小鼠CD4+CD25+ Treg細胞內存在表達。通過(guò)采用小RNA干擾技術(shù)（siRNA）沉默TIPE2表達，我們進(jìn)一步分析TIPE2對CD4+CD25+ Treg免疫抑制活性的影響，觀(guān)察到刺激活化的CD4+CD25+ Treg細胞CTLA-4和Foxp3表達明顯下降，同時(shí)IL-10和TGF-β生成量顯著(zhù)減少；此外，CD4+CD25+ Treg對效應T細胞的抑制功能明顯減弱。說(shuō)明TIPE2作為一種重要的負向調控分子，在CD4+CD25+ Treg細胞中表達并影響CD4+CD25+ Treg的免疫抑制功能[15]。

    4 研究展望

    綜上所述，負向調節途徑在膿毒癥復雜的炎癥免疫調控網(wǎng)絡(luò )中具有重要作用及意義。目前，膿毒癥確切發(fā)病機制、早期診斷與防止策略仍然是現代創(chuàng )（燒）傷外科和危重病醫學(xué)亟待解決的重大難題。對創(chuàng )（燒）傷后機體免疫功能平衡狀況與動(dòng)態(tài)變化的了解尚缺乏客觀(guān)準確的指標和評估體系，中樞和外周器官中免疫負向調節細胞、受體、分子及其信號通路改變能否為膿毒癥的早期識別、病程監測、預后評估提供有價(jià)值信息尚有待進(jìn)一步探討。負向調控途徑在膿毒癥免疫功能紊亂中的確切臨床意義如何？對疾病的轉歸發(fā)揮怎樣的調節效應？通過(guò)何種途徑實(shí)現對機體免疫反應的平衡調節等諸多關(guān)鍵問(wèn)題均有待深入研究。