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    前列腺癌是一種發(fā)病率頗高的泌尿系統惡性腫瘤。在世界范圍內，前列腺癌的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居第二，而在美國，前列腺癌的發(fā)病率已于2010年超越肺癌，成為第1位危害男性健康的腫瘤。在美國，僅2010年就有217730例新發(fā)前列腺癌病例，其中32050例死于該病。在我國，前列腺癌的發(fā)病率近年來(lái)也呈現上升趨勢，1993年，前列腺癌發(fā)病率為1.71人/10萬(wàn)人，死亡率為1.2人/10萬(wàn)人，1997年，前列腺癌發(fā)病率為2.0人/10萬(wàn)人，至2000年，前列腺癌發(fā)病率已上升至4.55人/10萬(wàn)人。2007年，上海市疾病預防控制中心報道的男性前列腺癌發(fā)病率為11.81人/10萬(wàn)人，居男性惡性腫瘤第5位。

    目前臨床上對于前列腺癌的早期診斷或篩查，主要依賴(lài)血清前列腺特異性抗原（PSA）水平。然而作為早期診斷的標記物，PSA仍然缺乏最佳的特異性和敏感性。因此，尋找新的前列腺癌分子診斷標記物來(lái)輔助或最終替代PSA作為前列腺癌的早期診斷標記，一直是臨床工作者研究的熱點(diǎn)。

    一、基因檢測在前列腺癌分子診斷標記物探索中的應用

    眾所周知，很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，除環(huán)境因素外，還與患者自身的遺傳特性有著(zhù)密切的關(guān)系，因此，在基因層面尋找前列腺癌分子標記物是人們很自然而然想到的方法。目前，已有一定數量的基因位點(diǎn)被認為可能與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。

    1.遺傳性前列腺癌基因區域1（HPC1）：位于1號染色體（1q24～25），是前列腺癌的一個(gè)重要基因易感區，在1q25位點(diǎn)存在2-5A合成酶依賴(lài)性基因（RNASEL）。該基因的改變，被認為與前列腺癌的發(fā)生存在著(zhù)密切的關(guān)系。同時(shí)R?kman等[5]的研究也證實(shí)，RNASEL中E265X片段的丟失和R462Q錯義突變與前列腺癌發(fā)病率的升高有關(guān)。可見(jiàn)，該基因區域具有成為前列腺癌分子診斷標記的潛力。

    2.TMPRSS2-ETS融合基因：TMPRSS2編碼一種雄激素依賴(lài)性的轉膜絲氨酸蛋白酶。而ETS編碼的轉錄因子可以調節很多與癌癥相關(guān)的生物過(guò)程。目前已有文獻報道，前列腺癌組織中廣泛存在著(zhù)位于21號染色體（21q22.3）的TMPRSS2-ETS融合基因。該融合基因使ETS基因借助TMPRSS2基因的啟動(dòng)子被激活，從而啟動(dòng)了ETS轉錄因子在癌癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用。目前，已有更多的學(xué)者在研究前列腺癌患者白細胞及其他組織細胞中這一融合基因的出現率，如果得出具有統計學(xué)意義的結果，則該融合基因可以作為前列腺癌早期診斷甚至預測的標記。

    3.腫瘤抑制基因CpG島高甲基化：位于腫瘤抑制基因啟動(dòng)子區域的CpG島的高甲基化是一個(gè)重要的基因失活機制。這一改變會(huì )破壞細胞信號通路的關(guān)鍵環(huán)節而導致惡性轉化和腫瘤演進(jìn)，該機制幾乎存在于所有腫瘤中。一系列研究證明檢測異常高甲基化在腫瘤檢測和進(jìn)展預測中具有很大的應用前景。目前研究表明，90%的前列腺癌中存在谷胱甘肽S轉移酶P1基因（GTSP1）高甲基化，它是前列腺癌中最常見(jiàn)的表觀(guān)遺傳學(xué)改變。有研究報道，聯(lián)合檢測GSTP1和APC基因的高甲基化，對前列腺癌的診斷敏感性高達98.3%，特異性為100%。而更重要的是，這一檢測目前已經(jīng)可以通過(guò)血清標本實(shí)現，這就為這一研究的臨床應用開(kāi)辟了更為廣闊的空間。

    上述研究主要是通過(guò)定量RT-PCR等“傳統”方法來(lái)進(jìn)行的。而近年來(lái)，全基因組相關(guān)性研究（GWAS）的迅猛發(fā)展，為前列腺癌發(fā)生相關(guān)基因的篩選提供了新的手段。這一技術(shù)是一種檢測特定物種中不同個(gè)體間的全部或大部分基因，從而了解不同個(gè)體間的基因變化有多大的一種方法。目前已有數十篇通過(guò)GWAS技術(shù)篩選前列腺癌發(fā)病相關(guān)基因的文獻發(fā)表，被報道的相關(guān)基因達數十個(gè)，但尚未發(fā)現其中的某一基因在診斷前列腺癌方面顯著(zhù)優(yōu)于其他基因。不過(guò)，隨著(zhù)GWAS技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，參與機構的增加以及病例數的累積，相信在不久的將來(lái)，即可篩選出可以用于診斷前列腺癌的標志性基因。

    二、蛋白質(zhì)芯片在前列腺癌分子診斷方面的貢獻

    蛋白質(zhì)芯片曾經(jīng)在多種疾病分子診斷標記物的篩選研究中風(fēng)靡一時(shí)。但近年來(lái)，隨著(zhù)更多新技術(shù)的發(fā)展，這一研究手段的“地位”已大不如前。但是，我們不應遺忘該技術(shù)為前列腺癌分子診斷標記物的探索所作出的貢獻。Gelmann等對PubMed上公布的芯片研究結果進(jìn)行了薈萃分析，比較了前列腺癌組織和正常組織，顯示了兩者之間一系列差異和共同點(diǎn)。以下分子標記物的篩選，均是通過(guò)這一技術(shù)實(shí)現的。

    1.前列腺癌抗原3（PCA3）：PCA3是近年來(lái)備受關(guān)注的前列腺癌分子診斷標記物之一。編碼這一蛋白的基因位于9號染色體上（9q21～22）。Hessels等首先報道了通過(guò)檢測尿液中PCA3的濃度來(lái)診斷前列腺癌的案例。有報道稱(chēng)，該蛋白在診斷前列腺癌方面的靈敏度和特異度分別為65%和66%，優(yōu)于經(jīng)典的標志物PSA。

    2.早期前列腺癌抗原（EPCA）：EPCA是一種核基質(zhì)蛋白。在前列腺癌與對照人群中EPCA染色強度具有統計學(xué)差異，其敏感性和特異性分別為84%和85%；同時(shí)發(fā)現具有病理陰性但抗EPCA抗體染色陽(yáng)性活檢組織的男性在將近5年或5年后被診斷為前列腺癌。因此，該蛋白不但具有診斷前列腺癌的作用，甚至可以用于前列腺癌發(fā)病的預測。

    三、同位素標記相對和絕對定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)在篩選前列腺癌分子診斷標記物中的應用

    iTRAQ是2004年美國應用生物系統公司推出的一種利用同位素標簽標記技術(shù)可以同時(shí)對相同實(shí)驗條件下4個(gè)樣本進(jìn)行定量研究的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。iTRAQ實(shí)際上是一種同位素標記試劑，包括一個(gè)帶電荷的報告基團，報告基團有四種相對分子質(zhì)量分別為114Da、115Da、116Da和117Da，另外還有一個(gè)肽段反應基團和一個(gè)平衡基團，平衡基團也有四種相對分子質(zhì)量分別為31Da、30Da、29Da和28Da。其中平衡基團平衡相對分子質(zhì)量，保證與每一種報告基團結合后iTRAQ試劑總的相對分子質(zhì)量都是145Da；肽段反應基團可以同肽段的N-末端和賴(lài)氨酸側鏈ε-氨基基團發(fā)生反應，這樣可以標記生物樣品產(chǎn)生的所有肽段，增強任一給定蛋白的肽段覆蓋度，同時(shí)保留了諸如一些蛋白的翻譯后修飾的重要結構信息。以四個(gè)樣本為例，實(shí)驗流程為：每個(gè)樣本進(jìn)行還原、烷基化及胰蛋白酶水解處理后，所有肽段進(jìn)行iTRAQ試劑標記，然后將所有樣品混合在一起進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析。標記的母體肽段經(jīng)過(guò)碰撞誘導的解離后，報告基團表現為分子量在114、115、116、117Da的報道離子，而且同時(shí)產(chǎn)生殘存的y-和b-離子化標記肽段。這些報道離子主要用于蛋白質(zhì)的相對定量。因為報道離子主要分布在低分子量區，一方面盡可能的忽略自身的重量，降低不同質(zhì)譜鑒定模式產(chǎn)生的差異；另一方面消除其他離子化片段的干擾，保證肽段豐度最高的可信度。因此報道離子豐度的差異，代表了不同樣本中同一肽段豐度的差異，從而最終確定不同樣本中同一蛋白質(zhì)豐度的差異即相對定量信息。而y-和b-離子化標記肽段主要用于蛋白質(zhì)鑒定。

    Glen等首次利用iTRAQ技術(shù)對前列腺癌細胞系進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，最終發(fā)現了10種蛋白存在上調，4種蛋白存在下調，存在差異表達的腦肌酸激酶（CKBB）、兒茶酚胺鄰位甲基轉移酶（COMT）、腫瘤排斥抗原（gp96）、葡萄糖調節蛋白78kDa（grp78）等已通過(guò)Western-blot和2DGE進(jìn)一步得到了驗證。

    筆者同樣通過(guò)這一技術(shù)，對中國人群中前列腺癌患者、前列腺上皮內瘤變（PIN）患者、良性前列腺增生（BPH）患者前列腺穿刺標本中各種蛋白的差異性進(jìn)行了分析，最終發(fā)現了TPD52、Prohibitin-2、EF-Tu在前列腺癌中分別上調4.25倍、4.57倍和3.02倍，而Decorin下調0.43倍。Western-blot的驗證結果與iTRAQ的分析結果相一致。

    因此我們可以認為，iTRAQ技術(shù)在前列腺癌分子標記物的篩選中具有很大的潛力。

    除了上述技術(shù)外，尚有免疫組化等方式可對前列腺癌患者與對照組中蛋白的差異進(jìn)行研究。相信隨著(zhù)各種實(shí)驗手段的發(fā)展，我們會(huì )找到更多的手段來(lái)尋找更具臨床意義的差異表達蛋白。

    四、總結與展望

    綜上所述，前列腺癌的診斷目前仍依賴(lài)于PSA的檢查。雖然很多新的分子診斷標記物（包括特定基因位點(diǎn)、差異蛋白等）已經(jīng)越來(lái)越多地被報道，但目前還都處于研究階段，正式應用于臨床尚需時(shí)日。不過(guò)，隨著(zhù)研究的進(jìn)展，被報道的標記物或研究手段會(huì )進(jìn)一步增加，這將為我們提供了一個(gè)巨大的“候選庫”，而從中篩選出最理想的前列腺癌分子診斷新標記也將不再困難。相信在不久的將來(lái)，我們可以找到一種或幾種具有高敏感性、高特異性，易于提取、檢驗的標記物，從根本上解決前列腺癌診斷中的種種困境，為廣大男性的健康做出新的貢獻。