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 　成體干細胞的研究目前以造血干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)為主，但取材困難，獲得率低等不利因素使其臨床應用受限。繼BMSC之后，脂肪源干細胞(ADSC)成為當今干細胞研究領(lǐng)域的又一熱點(diǎn)，美國的ZUK及日本的Mizuno等研究小組對此做了深入研究并取得了一定的進(jìn)展。ADSC與BMSC有許多相似的生物學(xué)特性，但ADSC還具有取材方便、易于培養、收獲細胞量大的優(yōu)勢。研究表明BMSC在造血調控中起著(zhù)關(guān)鍵的作用，而B(niǎo)MSC與造血干細胞共移植能夠促進(jìn)造血重建，原因在于分泌基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)。但ADSC是否可作為滋養層與骨髓細胞共培養刺激造血干/祖細胞(HSPC)增殖卻少見(jiàn)報道，為此我們以ADSC體外模擬造血微環(huán)境，觀(guān)察其對自身HSPC增殖的作用。

一、實(shí)驗方法

 　1.大鼠ADSC分離培養：本實(shí)驗鼠為SPF級SD大鼠，SD大鼠腹腔麻醉后，無(wú)菌條件下切取雙側腹股溝皮下脂肪，置人含有100 U/ml青霉素和100 U/m1鏈霉素的PBS液中浸泡10 min，用PBS反復沖洗，去除可見(jiàn)的血管及其他非脂肪組織，將脂肪組織剪成約1 mm3小塊，置于10 ml的0.1%I型膠原酶中，37℃搖床120 r/min消化30min，至懸液成糊狀，加入3倍體積的PBS終止消化，以1200×g離心10 min，棄上清，沉淀用含10%FBS的LG-DMEM培養液制成單細胞懸液。以2×105/cm2的密度接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱中培養，48 h首次換液，以后每3 d換液1次。細胞匯合達80%時(shí)消化傳代。

  　2.用流式細胞術(shù)(FCM)檢測ADSC免疫表型：分別取第3～6代細胞，用25 g/L胰蛋白酶消化后，PBS洗2次，制成1×106/ml的單細胞懸液，設陰性對照和同型對照組，分別加CD29-PE、CD34-PE、CD44-FITC、CD49d-FITC及CD106-PE單克隆抗體(單抗)，室溫下避光孵育15 min，FCM檢測。

  　3.成骨細胞誘導分化：①誘導組取第3代ADSC，待細胞融合80%，加入成骨細胞誘導液(加10%FBS、0.1μmol/LJ也塞米松、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的LG-DMEM)；②對照組：常規培養，每3 d換液1次。誘導7 d后，兩組均行茜素紅染色。

  　4.成脂細胞誘導分化：①誘導組：取第3代ADSC，待細胞融合80%，加入成脂細胞誘導液(含10%FBS 1 μmol/L、地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-異丁基1-甲基黃嘌呤、10 μmol/L胰島素的LG-DMEM培養液)；②對照組：常規培養，隔日換液。誘導7 d后，兩組均用油紅O染色。

  　5.BMSC對骨髓單個(gè)核細胞(BMNC)體外長(cháng)期培養擴增影響的觀(guān)察：取大鼠骨髓，制成單細胞懸液，用淋巴細胞分離液分離MNC，用LG-DMEM培養液調整細胞密度為5.0×105/ml，置于絲裂霉素C處理的BMSC上，共培養5周后用胰蛋白酶消化后重新接種，3 h后，收集上清中非貼壁細胞，甲基纖維素培養基(購白Stem cell公司)進(jìn)行細胞集落培養，培養14 d計數分析。

  　6.ADSC支持HSPC體外擴增能力的觀(guān)察：將BMNC作為長(cháng)期培養啟動(dòng)細胞(LTC-IC)，大鼠胚胎來(lái)源成纖維細胞、BMSC、ADSC作為滋養層。將實(shí)驗分為四組：A組：?jiǎn)渭傿MNC；B組：BMNC加成纖維細胞；C組：BMNC加BMSC；D組：BMNC加ADSC。在5%CO2、37 ℃、飽和濕度條件下進(jìn)行培養，每7 d換HSPC長(cháng)期培養液(購自Stem cell公司)，并于培養第7、14、28天取培養液中非貼壁細胞進(jìn)行細胞集落培養和分析，并于35 d收集上清，用ELESA方法檢測SDF-1，FCM檢測CD34陽(yáng)性細胞率。

二、結果

  　1.ADSC的增殖特征：原代細胞培養48 h首次換液，可見(jiàn)有少量細胞貼壁生長(cháng)，呈短小梭形，隨培養時(shí)間延長(cháng)，細胞呈簇狀生長(cháng)并匯合呈漩渦狀排列，培養5～7 d傳代，傳至第6代(P6)細胞形態(tài)呈梭形、大小較一致(圖1a)。

  　2.ADSC的免疫表型：經(jīng)FCM檢測，CD34+細胞占(18.9±6.2)%，CD49d+細胞占(0.8±0.2)%，CD29+細胞占(99.1±0.5)%，HCAM+細胞占(1.6±0.7)%，CDl06+細胞占(5.7±2.1)%，對照組均為陰性。

  　3.成脂細眙誘導升化：加入成脂細胞誘導培養養后2～3d，細胞開(kāi)始回縮變?yōu)槎嘟切危? d后細胞質(zhì)可見(jiàn)較少脂質(zhì)，7 d時(shí)匯合為較太的脂質(zhì).油紅O染包可見(jiàn)細胞脂滴染色呈陽(yáng)性(圖1b，)。

  　4.成骨細胞誘導分化加：成骨細胞誘導培養基后3 d細胞逐漸停止擴增變成短梭形約，10d形成結節樣結構，笫14天茜索紅辨色呈陽(yáng)性(圖1 c)。

　　a:倒置顯微鏡下ADSC形態(tài)（×200）；b ：ADSC成脂誘導分化后油紅O染色（×100）；c：ADSC成骨誘導分化后茜素紅染色（×200）

圖1   第3代脂肪源干細胞（ADSC）形態(tài)及成脂、成骨誘導分化后組化染色結果